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1、Next Generation SequencingSample fragmentationLibrary preparationSequencing reactionData analysisRoche 454 Roche 454 焦磷酸测序焦磷酸测序焦磷酸测序焦磷酸测序Pyrophosphate SequencingPyrophosphate SequencingIlluminaIllumina SolexaSolexa 合成测序合成测序合成测序合成测序Sequence by SynthesizeSequence by SynthesizeABI ABI SOLiDSOLiD 连接法测序连
2、接法测序连接法测序连接法测序Sequence by LigationSequence by Ligation第六部分第六部分 高通量测序技术简介高通量测序技术简介Roche 454 焦磷酸测序Pyrophosphate Sequencing基本原理454 sequencing：Emulsion PCR(emPCR)Mix DNA Library&capture beads(limited dilution)“Break micro-reactors”Isolate DNA containing beads Generation of millions of clonally amplified
3、 templates on each beadNo cloning and colony pickingCreate“Water-in-oil”emulsion+PCR Reagents+Emulsion Oil Perform emulsion PCR Adapter carrying library DNAABMicro-reactors Adapter complementEnrichAnneal SeqprimerCentrifuge StepLoad Enzyme Beads454 sequencing：Deposition of DNA beads into the PicoTit
4、erPlateLoad beads into PicoTiterPlate Illumina Solexa 合成测序Sequence by Synthesize基本原理Clonal Single Molecule Arrays单分子克隆1000 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square40 million clusters per experimentPrepare DNA fragmentsLigate adaptersAttach single molecules to surfaceAmplify to form c
5、lusters20 micronsSequenceReversible Terminator Chemistry可逆终止反应O PPPHNNOOcleavagesitefluor3blockNext cycleIncorporationDetectionDeblock;fluor removalODNAHNNOO3O5free 3 endXOHAll 4 labelled nucleotides in 1 reactionSequencing-by-Synthesis(SBS)5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTAFirst base incorporatedC
6、ycle 1:Add sequencing reagentsRemove unincorporated basesDetect signalCycle 2-n:Add sequencing reagents and repeat1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T The identity of each base of a cluster is read
7、 off from sequential images根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的应的DNA序列序列Base calling from the raw dataSolexa 测序测序 WorkflowABI SOLiD 连接法测序Sequence by Ligation基本原理文库制备：微珠单分子克隆1024种8碱基探针4色荧光，4种双核苷酸，每色荧光有256个探针(46)SOLiD 利用探针的连接反应读取模板的利用探针的连接反应读取模板的DNA序列序列连接法测序（一）每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序
8、引物读取的序列是不完整的每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的测序引物与测序引物与adapteradapter退火退火探针连接，检测荧光探针连接，检测荧光切除荧光基团切除荧光基团第二轮探针连接，检测荧光第二轮探针连接，检测荧光切除荧光基团切除荧光基团连接法测序（二）测序引物沿着测序引物沿着Adapter移动移动5次，确保每个位点都被检测次，确保每个位点都被检测连接法测序（三）0位置是位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次，的最后一个碱基，因此只检测一次，该碱基是进行解码所必须的。该碱基是进行解码所必须的。Advantage&disadva
9、ntage454 sequencing读取长度大，400bp可以对未知基因组进行从头测序de novo sequencing当遇到polymer时，如AAAAAA等，荧光强度和碱基个数不成线性关系，判定重复碱基个数有困难Solexa sequencing高度自动化的系统读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profiling基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给de novo sequencing 拼接带来困难SOLiD sequencing每个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测灵活的系统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的poo
10、ling，分割测序区域读取长度受连接反应的轮数限制，给de novo sequencing 拼接带来困难高通量测序的应用De novo 测序基因深度测序（genome re-sequencing）转录组深度测序（transcriptome re-sequencing）Digital expression profilingChIP-seqMethy-seqTranscriptome resequencing：malignant pleural mesotheliomas(MPMs)：恶性胸膜间皮瘤pulmonary adenocarcinoma(ADCA)：肺腺癌Transcriptome c
11、haracteristicsSolid line：at least one readDashed line：at least 20 readsExpression difference between MPM and ADCA sample compare to a lung tissue controlAnalysis of percent-age of reads containing known coding region SNVs in the six tissue samples.SNV：Single Nucleotide Substitution VariantDigital ex
12、pression profiling（1）：人大脑组织与UHR（Universal Human Reference）的表达差异Digital expression profilingµRNA re-sequencing：hESC：human embryonic stem cellsEB：embryoid bodiesChIP-seq（1）：人一号染色体DNA-蛋白相互作用ChIP-seq（2）：Sequencedshortreads(typically2550bp)from ChIP-Seq experiments are first mapped onto the referenc
13、e genome.The mapped reads are then used to estimate statistical parameters,which include the estimation of the average length Fof sequenced DNA fragments.Methy-seq（1）：肿瘤和MCF7细胞系中 BRCA!启动子区域的甲基化差异Some highlights:Correlation between ChIP-Seq and his prior SAGE-like method(called GMAT)has r=0.906Howeve
14、r the resolution with ChIP-Seq was dramatically higher.Furthermore,ChIP-Seq was more sensitive and generated less false-negative regions12,726 genes whose transcription levels are known in CD4+T-cells were correlated with the histone modifications and 35,961 Pol II binding site islands were identifi
15、edThis cost-effective method produces digital-quality data and should find broad applications in our efforts to understand the contribution of the human epigenomes in gene expression and epigenetic inheritanceMethy-seq（2）：部分参考文献阅读Genome re-sequencing van Orsouw N J,Hogers R C,Janssen A,et al.Complex
16、ity reduction of polymorphic sequences(CRoPS):a novel approach for large-scale polymorphism discovery in complex genomes.PLoS ONE,2007,2(11):e1172Hillier L W,Marth G T,Quinlan A R,et al.Whole-genome sequencing and variant discovery in C.elegans.Nat Methods,2008,5(2):183188Transcriptome re-sequencing
17、Mortazavi A,Williams B A,McCue K,et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.Nat Methods,2008,5(7):621628Sugarbaker D J,Richards W G,Gordon G J,et al.Transcriptome sequencing of malignant pleural mesothelioma tumors.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(9):35213526 Digital expression
18、 profilingRuby J G,Jan C,Player C,et al.Large-scale sequencing reveals 21U-RNAs and additional microRNAs and endogenous siRNAs in C.elegans.Cell,2006,127(6):11931207Morin R D,OConnor M D,Griffith M,et al.Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryo
19、nic stem cells.Genome Res,2008,18(4):610621ChIP-seqJohnson D S,Mortazavi A,Myers R M,et al.Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.Science,2007,316(5830):14971502Robertson G,Hirst M,Bainbridge M,et al.Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation a
20、nd massively parallel sequencing.Nat Methods,2007,4(8):651657藤晓坤，肖华胜藤晓坤，肖华胜藤晓坤，肖华胜藤晓坤，肖华胜*，基因芯片与高通量，基因芯片与高通量，基因芯片与高通量，基因芯片与高通量DNADNADNADNA测序技术前景分析。中国科学测序技术前景分析。中国科学测序技术前景分析。中国科学测序技术前景分析。中国科学C C C C辑：生命科学。辑：生命科学。辑：生命科学。辑：生命科学。2008200820082008：（：（：（：（38383838）10101010：1-91-91-91-9。TengTengTengTeng X,X
21、iao H.Perspectives of DNA microarray and next-generation X,Xiao H.Perspectives of DNA microarray and next-generation X,Xiao H.Perspectives of DNA microarray and next-generation X,Xiao H.Perspectives of DNA microarray and next-generation DNA sequencing technologies.DNA sequencing technologies.DNA seq
22、uencing technologies.DNA sequencing technologies.SciSciSciSci China C Life Sci.2009;52(1):7-16 China C Life Sci.2009;52(1):7-16 China C Life Sci.2009;52(1):7-16 China C Life Sci.2009;52(1):7-16 高通量测序技术虽然建立的时间不长高通量测序技术虽然建立的时间不长高通量测序技术虽然建立的时间不长高通量测序技术虽然建立的时间不长,但是在基因组的各个研究领域都显示但是在基因组的各个研究领域都显示但是在基因组的各个
23、研究领域都显示但是在基因组的各个研究领域都显示出其非凡的魅力出其非凡的魅力出其非凡的魅力出其非凡的魅力,而且日益显示出其对基因芯片而且日益显示出其对基因芯片而且日益显示出其对基因芯片而且日益显示出其对基因芯片“取而代之取而代之取而代之取而代之”的咄咄态势。的咄咄态势。的咄咄态势。的咄咄态势。那么那么那么那么,基因芯片向何处去呢？基因芯片向何处去呢？基因芯片向何处去呢？基因芯片向何处去呢？1.1.1.1.基因芯片技术经过近基因芯片技术经过近基因芯片技术经过近基因芯片技术经过近15151515年的发展已经形成了一个系统的平台。年的发展已经形成了一个系统的平台。年的发展已经形成了一个系统的平台。年的
24、发展已经形成了一个系统的平台。深度深度深度深度测序要建立这样的一个体系同样需要若干年的完善。测序要建立这样的一个体系同样需要若干年的完善。测序要建立这样的一个体系同样需要若干年的完善。测序要建立这样的一个体系同样需要若干年的完善。2.2.2.2.芯片杂交结果直观芯片杂交结果直观芯片杂交结果直观芯片杂交结果直观,分析快速分析快速分析快速分析快速,适合对大量生物学样适合对大量生物学样适合对大量生物学样适合对大量生物学样,品进行已知信品进行已知信品进行已知信品进行已知信息的检测息的检测息的检测息的检测,同时芯片数据分析有成熟完整的理论同时芯片数据分析有成熟完整的理论同时芯片数据分析有成熟完整的理论同
25、时芯片数据分析有成熟完整的理论,为后期数据分析提为后期数据分析提为后期数据分析提为后期数据分析提供强大的支持。供强大的支持。供强大的支持。供强大的支持。3.3.3.3.基因芯片的缺点基因芯片的缺点基因芯片的缺点基因芯片的缺点,就在于它是一个就在于它是一个就在于它是一个就在于它是一个“封闭系统封闭系统封闭系统封闭系统”,它只能检测人们已它只能检测人们已它只能检测人们已它只能检测人们已知序列的特征知序列的特征知序列的特征知序列的特征(或有限的变异或有限的变异或有限的变异或有限的变异)。4.4.4.4.而深度测序的强项而深度测序的强项而深度测序的强项而深度测序的强项,就在于它是一个就在于它是一个就在于它是一个就在于它是一个“开放系统开放系统开放系统开放系统”,它的发现能力和它的发现能力和它的发现能力和它的发现能力和寻找新的信息的能力寻找新的信息的能力寻找新的信息的能力寻找新的信息的能力,从本质上高于芯片技术。从本质上高于芯片技术。从本质上高于芯片技术。从本质上高于芯片技术。在一定程度上，这两种技术是优势互补，联合在一定程度上，这两种技术是优势互补，联合在一定程度上，这两种技术是优势互补，联合在一定程度上，这两种技术是优势互补，联合使用，将加快和加深我们的研究。使用，将加快和加深我们的研究。使用，将加快和加深我们的研究。使用，将加快和加深我们的研究。