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1、生物技术生物技术(Biotechnology):(Biotechnology):以生命科学为以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行加工生产，为社会提供商程原理相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。品和服务的一个综合性技术体系。生物技术是在分子生物学和细胞生物学基生物技术是在分子生物学和细胞生物学基础上结合现代工程学的方法和原理而发展起础上结合现代工程学的方法和原理而发展起来的一门综合性科学技术。来的一门综合性科学技术。第一节第一节
2、 组织与器官培养组织与器官培养第二节第二节 花药与花粉培养花药与花粉培养第三节第三节 原生质体培养原生质体培养第四节第四节 体细胞杂交体细胞杂交第五节第五节 植物细胞突变体的离体筛选植物细胞突变体的离体筛选第六节第六节 基因工程与育种基因工程与育种第七节第七节 分子标记与育种分子标记与育种主要内容：主要内容：植物组织培养植物组织培养（Plant Tissue Culture）l将植物离体器官、组织或细胞等外植体，在适宜将植物离体器官、组织或细胞等外植体，在适宜的人工培养基和无菌条件下，给予光照、温度等的人工培养基和无菌条件下，给予光照、温度等环境条件并培养，使其生长、增殖、发育形成小环境条件并
3、培养，使其生长、增殖、发育形成小植株的方法。植株的方法。l狭义的组织培养仅指愈伤组织培养，广义的组织培养指各狭义的组织培养仅指愈伤组织培养，广义的组织培养指各种类型的植物无菌培养技术。组织培养概念多指广义上的种类型的植物无菌培养技术。组织培养概念多指广义上的组织培养技术，包括胚胎培养、器官培养、组织培养组织培养技术，包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈愈伤组织培养伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养等。、细胞培养、原生质体培养等。植物特殊植物特殊倍性创造倍性创造植物植物组织培养组织培养培育植物培育植物新品种新品种种苗脱毒与种苗脱毒与快速繁殖快速繁殖体细胞杂交体细胞杂交次生产物次生产物生产生产基
4、础研究基础研究第一节第一节 组织与器官培养组织与器官培养组织与器官培养的类别组织与器官培养的类别组织与器官培养的应用组织与器官培养的应用茎尖和分生组织培养茎尖和分生组织培养胚培养胚培养胚珠和子房培养胚珠和子房培养胚乳培养胚乳培养离体叶的培养离体叶的培养组织与器官培养组织与器官培养(tissueandorganculture):):相关专业术语相关专业术语细胞全能性细胞全能性(totipotency):(totipotency):一个细胞所具有的产一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。生完整生物个体的固有能力。外植体外植体(explant):(explant):用于培养的离体材料。用于培养
5、的离体材料。愈伤组织愈伤组织(callus):(callus):在培养过程中，从植物各种器在培养过程中，从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。构和功能的细胞团。胚状体胚状体(embryoid):(embryoid):由外植体或愈伤组织产生的由外植体或愈伤组织产生的,与正常受精发育方式类似的胚胎结构。与正常受精发育方式类似的胚胎结构。继代培养继代培养(subculture)：对外植体增殖的培养：对外植体增殖的培养物物(包括细胞、组织或其切段包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代
6、培养。养基及不断切割或分离，进行连续多代培养。组织和器官培养全过程可分四个阶段组织和器官培养全过程可分四个阶段:无菌培养物的建立无菌培养物的建立营养繁殖体的增殖营养繁殖体的增殖生根生根植株移栽植株移栽各个阶段在培养基各个阶段在培养基,生长调节剂的配比和浓度生长调节剂的配比和浓度,培养方式和环境上都不同的要求培养方式和环境上都不同的要求.组织和器官培养在育种中的作用组织和器官培养在育种中的作用l加快园艺植物新品种和良种繁殖速度加快园艺植物新品种和良种繁殖速度l培养无病毒苗木培养无病毒苗木l诱发和离体筛选突变体诱发和离体筛选突变体l进行种质资源长期保存和远距离运输进行种质资源长期保存和远距离运输l
7、获得倍性不同的植株获得倍性不同的植株l克服种子发育和萌发中的障碍克服种子发育和萌发中的障碍l克服远源杂交困难克服远源杂交困难l提供育种中间材料提供育种中间材料第二节花药与花粉培养第二节花药与花粉培养花药培养花药培养花粉培养花粉培养花药培养：其外植体为花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。讲，属于器官培养的范畴。花粉培养：将处于一定花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢有时花粉培养也称为小孢子培养子培养(micr
8、ospore culture)。从培养方法和技。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。培养的范畴。花药培养的基本程序花药培养的基本程序外植体选择外植体选择外植体外植体(花蕾花蕾)预处理预处理外植体消毒外植体消毒剥取花药剥取花药接种接种诱导培养诱导培养分化培养分化培养 在离体培养条件下要使花药中的花在离体培养条件下要使花药中的花粉改变其正常发育方向而形成单倍体植粉改变其正常发育方向而形成单倍体植株，需要各种因素共同调节和控制。株，需要各种因素共同调节和控制。l 外因：培养基的成分，外源激素的种类，糖的浓度外因：培养基的成分，外源激素的种类，糖的浓度l 内因：主要决
9、定于花药中花粉发育时期内因：主要决定于花药中花粉发育时期培养基培养基花药培养常用的基本培养基：花药培养常用的基本培养基：MSMS（Murashigc&SkoogMurashigc&Skoog，19621962）；）；Nitsch(NitschNitsch(Nitsch，1969)1969)；N N6 6(朱至清，朱至清，1974)1974)；B B5 5(Gamborg etal.(Gamborg etal.，1976)1976)。附加成分：蔗糖附加成分：蔗糖,激素。激素。花药培养常用的激素花药培养常用的激素l细胞分裂素类：细胞分裂素类：BA6-benzyladeninKTkinetinZea
10、tin l生长素类：生长素类：NAAnaphthaleneaceticacidIAAindole-3-aceticacid2,4-D2,4-dichlorophenoxyaceticacid蔗糖蔗糖:蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供是：提供C C源；维持适宜的渗透压；抑制花源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度（）蔗糖浓度（）2 3 4 6 10 13 17 诱导频率（）诱导频率（）5 10 12 18 25 45 8l花粉发育时期
11、花粉发育时期四分体四分体 小孢子小孢子 单核花粉单核花粉双核花粉双核花粉 最适期最适期花粉及小孢子培养花粉及小孢子培养1 1取材时期的确定取材时期的确定四分体四分体单核早期单核早期单核晚期单核晚期双核早期双核早期双核晚期双核晚期三核期三核期小孢子小孢子花粉粒花粉粒花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。单倍体单倍体(haploid):指具有配子体染色体数的孢子体指具有配子体染色体数的孢子体(植植物个体物个体)。diploid 植物，其植物，其haploid即为即为monoploid 玉米玉米 2n=2x=20 n=x=10 柑橘柑橘 2n=2
12、x=18 n=x=9 tetraploid植物，其植物，其haploid为为dihaploid 马铃薯马铃薯 2n=4x=48 n=2x=24 hexaploid植物，其植物，其haploid为为triploid 普通小麦普通小麦 2n=6x=42 n=3x=21 octoploid植物，其植物，其haploid为为tetraploid 草草 莓莓 2n=8x=56 n=4x=28单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在l加倍后可迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。加倍后可迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。l获得育种中间材料。获得育种中间材料。l与诱变育种
13、相结合可以提高诱变频率。与诱变育种相结合可以提高诱变频率。l与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义，无籽三倍体。际应用意义，无籽三倍体。l作为遗传工程受体更为有效。作为遗传工程受体更为有效。l用于基础遗传研究的各个领域用于基础遗传研究的各个领域。l获得超雄植株（获得超雄植株（YY)YY)。l可获得异源体附加系、代换系和易位系。可获得异源体附加系、代换系和易位系。第三节第三节 原生质体培养原生质体培养u原生质体培养和体细胞杂交的步骤原生质体培养和体细胞杂交的步骤u原生质体培养原生质体培养（Protoplastculture）u体细胞杂交体细胞杂
14、交（Somatichybridization）u原生质体融合（原生质体融合（Protoplastfusion）一一.原生质体的概念原生质体的概念l原生质体原生质体(protoplast)(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。膜所包围的裸露细胞。l亚原生质体亚原生质体(subprotoplast)(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞
15、核。原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。l核质体核质体(nuclearplast)(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)(miniprotoplast)。l胞质体（胞质体（cytoplastcytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。生质体。二二.原生质体的分离原生质体的分离基础材料准备基础材料准备预处理与酶解预处理与酶解原生质体活力测定原生质体活力测定原生质体收集与纯化原生质
16、体收集与纯化1.1.分离原生质体材料的准备分离原生质体材料的准备l无菌试管苗叶片无菌试管苗叶片l上胚轴和子叶上胚轴和子叶l培养细胞培养细胞2.2.预处理及酶解预处理及酶解酶酶酶解酶解渗透压渗透压调节剂调节剂l材料预处理材料预处理在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。高某些材料原生质体的活力和分裂频率。用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料
17、类型预处理方法不同。法不同。例如龙胆试管苗的叶片只有用例如龙胆试管苗的叶片只有用44低温处理，甘蔗植株必须先低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养在黑暗条件下培养12h12h后分离的原生质体才能分裂。后分离的原生质体才能分裂。原生质体分离常用的商品酶原生质体分离常用的商品酶 酶酶来来 源源生产厂家生产厂家 纤维素酶类纤维素酶类 onozuka Ronozuka R1010绿色木霉绿色木霉Yakult Honsha Co.Ltd.,Tokyo,JapanYakult Honsha Co.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysinCellulysin绿色木霉绿色木霉Calbiochem
18、.,San Diego,CA 92037,USACalbiochem.,San Diego,CA 92037,USADriselaseDriselaseIrpex lutensIrpex lutensKayowa Hakko Kogyo Co.,Tokyo,Japan Kayowa Hakko Kogyo Co.,Tokyo,Japan 果胶酶类果胶酶类Macerozyme R-10Macerozyme R-10根霉根霉Yakylt Honsha Co.Ltd.,Tokyo,Japan Yakylt Honsha Co.Ltd.,Tokyo,Japan PectinasePectinase黑曲
19、霉黑曲霉Sigma Chemical Co.,St.Louit,MO 63178,USASigma Chemical Co.,St.Louit,MO 63178,USAPectolyase Y-23Pectolyase Y-23黑曲霉黑曲霉Seishin Pharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan Seishin Pharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan 半纤维素酶半纤维素酶 Rhozyme HP-150Rhozyme HP-150黑曲酶黑曲酶Rohm and Hass Co.,Philadelphia,PA 19105,Rohm and Hass Co.,Philadelp
20、hia,PA 19105,USA USA l酶溶剂及其渗透压酶溶剂及其渗透压溶剂：原生质体培养基或特殊配制。溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶处理酶处理 酶解温度酶解温度酶浓度酶浓度酶解时间酶解时间l3、原原生生质质体体的的分分离离纯纯化化原生质体的收集和纯化原生质体的收集和纯化l飘浮法：常用的飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、飘浮剂有蔗糖、PercollPercoll、FicollFicoll。l沉淀法：常用甘沉淀法：常用甘露醇作为渗透压露醇作为渗透压调节剂，先将酶调节剂，先将酶液洗出干净，再液洗出干净，再用用Perc
21、ollPercoll飘浮一飘浮一次次。4.4.原生质体活力测定原生质体活力测定l目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。动性确定原生质体活力。lFDAFDA法：法：FDAFDA（二乙酸荧光素）是一种非极性（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDAFDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。镜下通过具荧光的细胞的
22、观察确定细胞活性。l伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏，细胞才能被染色，因而可以通过到严重损坏，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。细胞被染色与否确定活性。FDA荧光染色法荧光染色法(双醋酸荧光素双醋酸荧光素)在荧光显微镜下，在荧光显微镜下，有活力的原生质发荧有活力的原生质发荧光，无活力的不发荧光，无活力的不发荧光。光。生活力测定：生活力测定：影响原生质体活力的因素影响原生质体活力的因素l分离材料的生理状态分离材料的生理状态l酶解条件酶解条件 酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间
23、、酶溶液的渗透压l分离条件分离条件 离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间l环境条件环境条件 操作环境的温度、分离用具的影响操作环境的温度、分离用具的影响 三、原生质体培养三、原生质体培养原生质体培养基原生质体培养基原生质体培养方法原生质体培养方法1.1.原生质体培养基原生质体培养基C无机盐无机盐大量元素浓度；大量元素浓度；NONO3 3和和NHNH4 4+的比例；的比例；CaCa2+2+浓度浓度C有机成分有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。水解酪蛋白。2 2、原生质体培养方法、原生质
24、体培养方法l液体浅层培养液体浅层培养l固体平板培养固体平板培养l固固-液体双层培养液体双层培养l琼脂糖珠培养琼脂糖珠培养 原原生生质质体体培培养养柑桔融合实例第四节第四节 体细胞杂交体细胞杂交l定义：定义：将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）l几种不同的表述：几种不同的表述：体细胞杂交：体细胞杂交：Somatichybridization细胞融合：细胞融合：Cellfusion原生质体融合：原生质体融合：Protoplastfusion无性杂交：无性杂交：asexu
25、alhybridization超性杂交：超性杂交：Parasexualhybridization超性融合：超性融合：Parasexualfusion细胞工程：细胞工程：Cellengineering植物细胞杂交的几个重要进展植物细胞杂交的几个重要进展 1960年，年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971年，年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；株；1972年，年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个
26、植物细胞杂种；是第一个植物细胞杂种；1974年，年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；了相应的融合技术；1978年，年，Melchers获得第获得第1个属间细胞杂种（番茄马铃薯）；个属间细胞杂种（番茄马铃薯）；1981年，年，Zimmerman发明电融合仪，并首次提出电融合概念；发明电融合仪，并首次提出电融合概念；1987年，年，Schweiger建立单对原生质体电融合技术程序。建立单对原生质体电融合技术程序。体细胞杂交与有性杂交的异同体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容比较内容体细胞杂交体细胞杂交有性杂交有性杂交时间
27、时间无季节限制无季节限制花期限制，特别花期限制，特别是母本的花期是母本的花期亲缘关系亲缘关系一定程度上可以克服一定程度上可以克服有性有性/嫁接不亲和性嫁接不亲和性受亲和性影响受亲和性影响结果结果细胞核、细胞质均可细胞核、细胞质均可以重组、倍性增加以重组、倍性增加双受精，一般无双受精，一般无细胞质重组，倍细胞质重组，倍性不改变性不改变+体细胞杂交体细胞杂交有性杂交有性杂交原生质体融合的有关名词原生质体融合的有关名词-Il对称杂种对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%）l非对称杂种非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对
28、值）对值）胞质杂种（胞质杂种（cytoplasmichybrid,Cybrid）：细胞质重组，）：细胞质重组，细胞核未重组细胞核未重组l对称融合对称融合（symmetricfusion）也称也称标准融合标准融合（Standardfusion）l非对称融合非对称融合（asymmetricfusion）：融合前对一方）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分进行处理，使其染色体丢失一部分原生质体融合的有关名词原生质体融合的有关名词-IIl供供-受体融合：受体融合：Donor-recipientfusionl体配融合体配融合（gameto-somaticfusion）（性细胞与体）（性细胞与体细
29、胞融合）细胞融合）l亚原生质体亚原生质体-原生质体融合：原生质体融合：Subprotoplast-protoplastfusion小原生质体：小原生质体：Miniprotoplast微原生质体：微原生质体：Microprotoplast胞质体：胞质体：Cytoplastl胞质体胞质体-原生质体融合原生质体融合:Cytoplast-protoplastfusion原生质体融合的方式原生质体融合的方式l化学方法：化学方法：聚乙二醇法聚乙二醇法Polyethyleneglycol（PEG），与高），与高pH高高Ca结合使用结合使用l物理方法：物理方法：电融合法电融合法Electrofusion,El
30、ectricallyinducedfusionl 理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对种质资源的开发和利用具有深为新的生物资源，这对种质资源的开发和利用具有深远的意义。远的意义。l 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。径。l 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、遗传系统，在杂种的分裂和增殖过
31、程中双亲的叶绿体、线粒体线粒体DNADNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。统。体细胞杂交的程序及方法体细胞杂交的程序及方法原生质体融合原生质体融合杂种细胞筛选杂种细胞筛选方法：方法：PEG，电，电融合，融合，NaNO3营养互补选择法，营养互补选择法，遗传互补选择法，遗传互补选择法，机械选择法，机械选择法，形态学方法形态学方法 细胞学方法细胞学方法同工酶方法同工酶方法分子标记法分子标记法体细胞杂种植株的鉴定体细胞杂种植株的鉴定亲本亲本A亲本亲本B原生质体聚合原生质体聚合融合处理融合处理分离的原生质体分离的原生质体原生质体融合原生质体融合融合体移植融合体
32、移植杂种融合体筛选杂种融合体筛选杂种融合体移栽杂种融合体移栽至不同的培养基至不同的培养基体细胞杂交筛选体细胞杂交筛选原生质体培养和体细胞杂交的应用原生质体培养和体细胞杂交的应用获得新品种；获得新品种；创造新种质；创造新种质；转移有利性状和克服远源杂交的障碍；转移有利性状和克服远源杂交的障碍；作为基因工程的良好受体及进行突变体作为基因工程的良好受体及进行突变体筛选的优良原始材料。筛选的优良原始材料。第五节第五节 植物细胞突变体的离体筛选植物细胞突变体的离体筛选 在离体培养条件下，诱发突变的突变型和自发突变没有本质在离体培养条件下，诱发突变的突变型和自发突变没有本质上的差别。一般都在三个水平上发生
33、：上的差别。一般都在三个水平上发生：u基因组突变：染色体数目的改变或细胞质基因组的增减；基因组突变：染色体数目的改变或细胞质基因组的增减；u染色体突变：染色体较大范围的结构变化，涉及多个基因；染色体突变：染色体较大范围的结构变化，涉及多个基因；u基因突变：指范围在一个基因以内分子结构的基因突变：指范围在一个基因以内分子结构的 改变。按改变。按DNADNA改变方式有碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。改变方式有碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。u体细胞无性系变异：体细胞无性系变异：Somaclonal variationSomaclonal variation一、突变体的产生一
34、、突变体的产生二、突变细胞的筛选方法二、突变细胞的筛选方法直接选择法正选择正选择/负选择负选择间接选择法正选择正选择l用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。一途径，已从多种
35、植物中筛选出可利用的体细胞变异体。贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4NaCl的的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系培养基上直接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系游离氨基酸含量是供体亲本的游离氨基酸含量是供体亲本的4.1倍。倍。郑企成等也曾将小麦郑企成等也曾将小麦“京花京花1号号”花药经花药经射线处理后，再射线处理后，再经经0.5NaCl培养基直接筛选获得耐盐再生株系。培养基直接筛选获得耐盐再生株系。李爱贤等以甘薯李爱贤等以甘薯“栗子香栗子香”为材料诱导胚性细胞系，从为材料诱导胚性细胞系，从900个通过个通过射线辐射的细胞团中，
36、在含有射线辐射的细胞团中，在含有2.0NaCl的培的培养基中进行筛选，获得养基中进行筛选，获得22个抗盐愈伤组织，并获得个抗盐愈伤组织，并获得20个抗个抗盐再生植株。盐再生植株。负选择负选择l一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。指标的筛选方法。Dorffling等以等以Pro类似物羟脯氨酸（类似物羟脯氨酸（HYP）为选择）为选择剂，获得了耐剂，获得了耐HYP的体细胞变异系，其抗寒性比供的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传。体亲本增强，且能稳定遗传。林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织
37、的悬浮细胞经射射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，并再生植株。鉴获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，并再生植株。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高比供体提高1.4和和2.4，突变系体内的，突变系体内的Pro含量比含量比供体增加了一倍。供体增加了一倍。三、突变性状遗传基础及其稳定性鉴定三、突变性状遗传基础及其稳定性鉴定遗传基础遗传基础稳定性稳定性突变性状的遗传学基础突变性状的遗传学基础l体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的体细胞变异，除发生在染色体水
38、平外，更多的是基因水平上的变异。是基因水平上的变异。l从利用体细胞变异的角度，染色体变异大多是从利用体细胞变异的角度，染色体变异大多是一些畸形变异，真正可利用的染色体变异十分一些畸形变异，真正可利用的染色体变异十分有限。有限。l基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的改变，不会影响再生植株的正常生长发育。的改变，不会影响再生植株的正常生长发育。因此，从再生植株的这些变异中有可能筛选有因此，从再生植株的这些变异中有可能筛选有益的变异。益的变异。l基因水平上的变异，从根本上讲是基因水平上的变异，从根本上讲是DNA的碱基的碱基突变或修饰状态的改变。突变或修饰
39、状态的改变。突变性状的稳定性突变性状的稳定性l对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。Brettell等从等从645株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个稳株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个稳定突变体定突变体Adh1（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分析发（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的GA
40、G中的中的A转换转换成为了成为了T，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。l植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。Genetic Engineering and Breeding第六节第六节 基因工程与育种基因工程与育种植物基因工程（植物基因工程（plant genetic engineering）：指）：指以类似工程设计的
41、方法，按照人们的意志，通过一以类似工程设计的方法，按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的定的程序，将具有遗传信息的DNA片断，在离体条片断，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因引入适当的植物受体中进行复制和表达重组的基因引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。的技术。转基因植物：转基因植物：transgenic plant转基因技术转基因技术:Transgenic technique一、Definition指把不同生物有机体的DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组DNA(recombinat
42、ionDNA)分子，然后转化到受体细胞（如,大肠杆菌），使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译和表达。基因工程基因工程:基因分离、克隆基因分离、克隆农杆菌介导农杆菌介导基因枪介导基因枪介导基因插入Ti/Ri质粒载体农 杆 菌 侵染植物包裹DNA的微粒弹质 粒 DNA制备基基因因质质粒粒进进入植物细胞入植物细胞DNA整 合 进植物染色体基因枪轰击植物细胞基因枪轰击植物细胞检测转基因检测转基因筛选转基因细胞筛选转基因细胞转基因细胞再生植株转基因细胞再生植株检测转基因检测转基因农农杆杆菌菌和和基基因因枪枪介介导导基基因因转转化化流流程程图图基因工
43、程的基本步骤和方法基因工程的基本步骤和方法l目的基因的分离与鉴定目的基因的分离与鉴定l植物表达载体的构建植物表达载体的构建l植物的遗传转化植物的遗传转化l转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定各种来源目的基各种来源目的基因的分离与克隆因的分离与克隆克隆基因的鉴定和分析克隆基因的鉴定和分析有用基因的亚克隆有用基因的亚克隆待改良植物的选择和预处理待改良植物的选择和预处理植物受体细胞系统制备植物受体细胞系统制备植物细胞的遗传转化植物细胞的遗传转化异源基因在植物细胞中异源基因在植物细胞中的整合与表达的整合与表达转基因植株的育成和转化转基因植株的育成和转化含异源基因的重
44、组含异源基因的重组细胞的筛选和培养细胞的筛选和培养重组细胞的分裂与分化重组细胞的分裂与分化植物基因转移的过程植物基因转移的过程二、基因工程在园艺植物育种中的应用二、基因工程在园艺植物育种中的应用l改良品质改良品质l提高抗病虫能力提高抗病虫能力l改良抗逆性改良抗逆性l提高光合作用和固氮效率提高光合作用和固氮效率l创建雄性不育材料创建雄性不育材料l延迟成熟与保鲜延迟成熟与保鲜l选育抗除草剂品种选育抗除草剂品种(提高抗病能力提高抗病能力抗抗细菌细菌基因工程途径基因工程途径:过量表达法过量表达法克隆转化溶菌酶基克隆转化溶菌酶基因或杀菌肽基因因或杀菌肽基因抗抗真菌真菌基因工程途径基因工程途径:克隆并导入
45、几丁质酶基克隆并导入几丁质酶基因和因和-1,3-葡聚糖酶基因葡聚糖酶基因克隆并导入抗毒素克隆并导入抗毒素过量表达来自番茄PR蛋白的甜橙抗脚腐病过量表达CTV CP蛋白的来檬抗CTVlThep25coatprotein(CP)geneofCitrustristezavirus(CTV)wasincorporatedtoMexicanlimeplantsandforty-twotransgeniclineswereproduced,25containingthep25CPgeneofthesevereCTVstrainT-305and17withthatofthemildstrainT-317.W
46、henplantspropagatedfromeachtransgeniclineweregraft-inoculatedwithCTVT-305oraphidinoculatedwithT-300,twotypesofresponsetoviralchallengewereobserved:somelinesdevelopedCTVsymptomssimilartothoseofnon-transgeniccontrols,whereasothersexhibitedprotectionagainstthevirus.Thisprotectionconsistedofaproportiono
47、fplants,rangingfrom10to33%,thatwereresistanttoCTV,andtherestofthemthatshowedasignificantdelayinvirusaccumulationandsymptomonset.Protectionwasefficientagainstnon-homologousCTVstrainsandwasgenerallyaccompaniedbyhighaccumulationofp25CPintheprotectedlines,whichsuggestaCP-mediatedprotectionmechanisminmos
48、tcases.Molecular Breeding 2002,10:110实例CTV symptoms of different intensity in young leaves after graft-inoculation with CTV T-305.Severe leaf distortion and stuntingsymptoms in a non-transgenic control plant(left),delay in virusinfection and symptom attenuation in a transgenic plant(centre),andresis
49、tanceagainstCTVT-305inothertransgenicplant(right).如.1986年Beachy等将烟草花叶病毒的外壳蛋白基因（TMV-CP)导入烟草中，发现转基因植株发病时间明显延迟或病毒的症状明显减轻。抗病毒基因工程途径抗病毒基因工程途径:向植物中导入病毒外壳蛋白（向植物中导入病毒外壳蛋白（CP）转移病毒的反义转移病毒的反义RNA,卫星卫星RNA,病毒复制酶基因和核酶基因等病毒复制酶基因和核酶基因等转病毒CP基因番木瓜CKTransn fire blight抗性:1000ha apple were killed by FB in Michigan in 200
50、0.Lytic protein(LP)：Royal Gala,Galaxy 和和M26转转avian LPs SB-37,T-4 lysozyme：Gala转转harpin（来于（来于Fire blight细菌）细菌）NPR1蛋白：过量表达蛋白：过量表达Silencing the DIPM kinase which is related to the occurrence of the disease.实例：苹果实例：苹果转attacin LP基因的Royal Galan4年田间试验表明：抗性增强，果实品质正常。转attacin基因的苹果抗fire blight转avian lysozyme基