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1、第十五章第十五章 生物技术在植物育种中的应用生物技术在植物育种中的应用一一 细胞和组织培养在植物育种中的应用细胞和组织培养在植物育种中的应用1 体细胞变异体和突变体的筛选体细胞变异体和突变体的筛选无性系变异无性系变异（somaclonal variation）：植物体细胞在：植物体细胞在离体条件下，以及在离体培养之前，会发生各种离体条件下，以及在离体培养之前，会发生各种遗传和不遗传的变异，把遗传的变异称为无性系遗传和不遗传的变异，把遗传的变异称为无性系变异。变异。变异体变异体（varient）：不加任何选择压力而筛选出的变：不加任何选择压力而筛选出的变 异个体。异个体。突变体突变体（mutan
2、t）：经过施加某种选择压力所筛选出：经过施加某种选择压力所筛选出 的无性系变异。的无性系变异。（1）通过组织培养获得变异体或突变体的方式）通过组织培养获得变异体或突变体的方式 方法方法 a 组培之前的变异及选择组培之前的变异及选择 例：烟草抗除草剂变异体的筛选例：烟草抗除草剂变异体的筛选 （灭草松、甲二威灵）（灭草松、甲二威灵）b 组培期间的变异及选择：正向选择组培期间的变异及选择：正向选择例：例：玉米抗小斑病玉米抗小斑病T T小种小种 未成熟胚未成熟胚 愈伤组织愈伤组织 加加T T小种毒素小种毒素 抗性愈伤组织抗性愈伤组织 移栽移栽 再生植株再生植株高粱胚性愈伤组织高粱胚性愈伤组织c 组培后
3、的选择和鉴定组培后的选择和鉴定 培养基不包含特定的选择因素，但包含诱培养基不包含特定的选择因素，但包含诱变剂。变剂。这种选择多局限于形态性状，如株型、叶这种选择多局限于形态性状，如株型、叶色以及其他可见的性状。色以及其他可见的性状。（2）体细胞无性系选择工作中的几个问题）体细胞无性系选择工作中的几个问题 a 选择目标的确定选择目标的确定 b 外植体的选择外植体的选择 c 培养系统的选择培养系统的选择 包括包括器官发生系统器官发生系统和和胚胎发生系统胚胎发生系统 d 无性系变异的选择无性系变异的选择2 离体培养技术在植物育种中的应用离体培养技术在植物育种中的应用（1）胚珠或子房培养与试管授精）胚
4、珠或子房培养与试管授精（2）离体胚的培养在育种中的应用）离体胚的培养在育种中的应用 a 使远缘杂种的胚发育成植株使远缘杂种的胚发育成植株 b 促进核果类植物胚的后熟作用促进核果类植物胚的后熟作用 c 打破种子的休眠期打破种子的休眠期3 细胞和组织培养技术的其他利用途径细胞和组织培养技术的其他利用途径（1）快速繁殖）快速繁殖 大多数果树、观赏植物是杂合的，若要保持大多数果树、观赏植物是杂合的，若要保持原种特性，需利用茎尖培养快速繁殖。原种特性，需利用茎尖培养快速繁殖。（2）种质保存）种质保存 有些植物种质的保存正式采用组培的方法。有些植物种质的保存正式采用组培的方法。传统的种质保存方式是种子繁殖
5、和保存，但种传统的种质保存方式是种子繁殖和保存，但种子生命力下降，易受病虫害侵袭。细胞培养和子生命力下降，易受病虫害侵袭。细胞培养和茎尖培养再生植株技术为种质保存提供了条件。茎尖培养再生植株技术为种质保存提供了条件。（3）产生无病毒植物材料）产生无病毒植物材料 通过组织培养可以淘汰病毒，还可能淘汰某通过组织培养可以淘汰病毒，还可能淘汰某些细菌，通过此法进行脱毒，如马铃薯。些细菌，通过此法进行脱毒，如马铃薯。马铃薯脱毒种薯快速繁殖马铃薯脱毒种薯快速繁殖二二 植物原生质体培养和体细胞杂植物原生质体培养和体细胞杂交交1 基本概念及意义基本概念及意义l原生质体原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸：指
6、用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。露的、有生活力的原生质团。l体细胞杂交体细胞杂交（somatic hybridization）：又称：又称原生质体融合（原生质体融合（protoplast fussion），是指，是指两种原生质体间的杂交。两种原生质体间的杂交。2 原生质体的分离和培养原生质体的分离和培养（1）先进行细胞或组织培养）先进行细胞或组织培养（2）利用胚性细胞系游离原生质体）利用胚性细胞系游离原生质体（3）选用合适的培养基和方法）选用合适的培养基和方法（4）选择合适的酶制剂）选择合适的酶制剂3 原生质体的融合原生质体的融合 关键是融合剂的选用。关键是融合剂的选用。早
7、期用早期用0.25mol/L的的NaNO3和高和高Ca2+;后来后来用用PEG和和Ca2+、高、高PH溶液；最近用电融合技溶液；最近用电融合技术。术。电融合仪电融合仪电融合仪电融合仪原生质体电融合原生质体电融合原生质体电融合原生质体电融合4 杂种细胞的鉴定和选择杂种细胞的鉴定和选择（1）用选择性培养基培养）用选择性培养基培养（2）互补选择法）互补选择法（3）异核体机械分离和杂种细胞的核型分析）异核体机械分离和杂种细胞的核型分析（4）体细胞杂种和胞质杂种的鉴别）体细胞杂种和胞质杂种的鉴别三三 重组重组DNA技术在植物育种中的技术在植物育种中的应用应用1 目的基因的获得目的基因的获得（1）根据基因
8、表达的产物）根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆蛋白进行基因克隆l 分离和纯化控制目的性状的蛋白质或多态，进行氨基分离和纯化控制目的性状的蛋白质或多态，进行氨基酸酸 序列分析序列分析l 根据所的氨基酸序列推导相应的核苷酸序列根据所的氨基酸序列推导相应的核苷酸序列;l 采用化学合成的方法合成该基因采用化学合成的方法合成该基因;l 通过相应的功能鉴定来确定所推导的序列是否为目的通过相应的功能鉴定来确定所推导的序列是否为目的 基因。基因。（2）从基因组）从基因组DNA或或mRNA序列克隆基因序列克隆基因 同源序列法和表达序列标签法同源序列法和表达序列标签法u同源序列法是根据基因家族成员所编码的蛋白同源
9、序列法是根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点发展的一质结构中具有保守氨基酸序列的特点发展的一条快捷克隆即因家族未知成员的新途径，即基条快捷克隆即因家族未知成员的新途径，即基于同源序列的候选基因法。于同源序列的候选基因法。u表达序列标签是指能够特异性标记某个基因的表达序列标签是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的信息区，部分序列，通常包含了该基因足够的信息区，因而可以和其他基因相区分。目前，表达序列因而可以和其他基因相区分。目前，表达序列标签主要是通过标签主要是通过cDNAcDNA的途径获得。的途径获得。2 目的基因重组质粒的构建目的基因重组质粒的构
10、建 质粒重组的基本步骤：质粒重组的基本步骤：v从原核生物中获取目的基因的载体并从原核生物中获取目的基因的载体并进行改造；进行改造；v利用限制性内切核酸酶将载体切开，利用限制性内切核酸酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，并用连接酶把目的基因连接到载体上，获得获得DNADNA重组体。重组体。3 受体材料的选择受体材料的选择 良好的植物基因转化系统应具有的条件：良好的植物基因转化系统应具有的条件：高效稳定的再生能力；高效稳定的再生能力；受体材料要有较高的遗传能力；受体材料要有较高的遗传能力；具有稳定的外植体来源；具有稳定的外植体来源；对筛选剂敏感。对筛选剂敏感。（1）愈伤组织再生系统）愈
11、伤组织再生系统（2）直接分化再生系统）直接分化再生系统（3）原生质体再生系统）原生质体再生系统（4）胚状体再生系统）胚状体再生系统（5）生殖细胞受体系统）生殖细胞受体系统4 转基因方法的确定和外源基因的转化转基因方法的确定和外源基因的转化（1）载体介导转移系统）载体介导转移系统 主要方法有：主要方法有：叶盘法叶盘法真空渗入法真空渗入法原生质体共培养法原生质体共培养法（2）外源基因直接导入法）外源基因直接导入法 这是一种不需要借助载体介导，直接利用这是一种不需要借助载体介导，直接利用理化因素进行外源遗传物质转移的方法。理化因素进行外源遗传物质转移的方法。a 化学刺激法化学刺激法 b 基因枪轰击法
12、基因枪轰击法 c 电击法电击法 d 微注射法微注射法5 转化体的筛选和鉴定转化体的筛选和鉴定（1）转化体的筛选）转化体的筛选（2）转化体的鉴定）转化体的鉴定 a DNAa DNA水平的鉴定水平的鉴定SouthernSouthern杂交杂交 b b 转录水平的鉴定转录水平的鉴定 NorthernNorthern杂交和检测杂交和检测 翻译水平的鉴定翻译水平的鉴定四四 转基因作物品种的选育转基因作物品种的选育转基因大豆转基因大豆转基因大豆转基因大豆转基因玉米转基因玉米转基因玉米转基因玉米 转基因小麦和棉花转基因小麦和棉花转基因小麦和棉花转基因小麦和棉花（注：上述四张图片来自网络）（注：上述四张图片来
13、自网络）（注：上述四张图片来自网络）（注：上述四张图片来自网络）1 1 转基因作物育种目标的制定转基因作物育种目标的制定l依据市场经济的需要和生产发展前景依据市场经济的需要和生产发展前景l依据不同的自然环境、栽培条件依据不同的自然环境、栽培条件l落实具体性状目标落实具体性状目标l要考虑品种的搭配要考虑品种的搭配l要充分考虑转基因作物，尤其是外援目的基因要充分考虑转基因作物，尤其是外援目的基因对对人类健康人类健康和和环境安全环境安全的影响的影响2 2 转基因方法的确定及转基因植株的获得转基因方法的确定及转基因植株的获得3 3 转基因作物品种的选育转基因作物品种的选育 纯系育种、回交育种、杂交育种、杂种品种纯系育种、回交育种、杂交育种、杂种品种