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1、微生物检验方法验证第1页，本讲稿共20页重点议题m一、法规要求m二、验证目的m三、检验概述m四、总菌落数检查方法验证m五、控制菌检查方法验证m六、无菌检查方法验证第2页，本讲稿共20页一、法规要求第二百二十六条 试剂、试液、培养基和检定菌的管理应当至少符合以下要求：m（一）试剂和培养基应当从可靠的供应商处采购，必要时应当对供应商进行评估；m（二）应当有接收试剂、试液、培养基的记录，必要时，应当在试剂、试液、培养基的容器上标注接收日期；m（三）应当按照相关规定或使用说明配制、贮存和使用试剂、试液和培养基。特殊情况下，在接收或使用前，还应当对试剂进行鉴别或其他检验；m（四）试液和已配制的培养基应当
2、标注配制批号、配制日期和配制人员姓名，并有配制（包括灭菌）记录。不稳定的试剂、试液和培养基应当标注有效期及特殊贮存条件。标准液、滴定液还应当标注最后一次标化的日期和校正因子，并有标化记录；第3页，本讲稿共20页一、法规要求第二百二十六条 （续）m（五）配制的培养基应当进行适用性检查，并有相关记录。应当有培养基使用记录；m（六）应当有检验所需的各种检定菌，并建立检定菌保存、传代、使用、销毁的操作规程和相应记录；m（七）检定菌应当有适当的标识，内容至少包括菌种名称、编号、代次、传代 日期、传代操作人；m（八）检定菌应当按照规定的条件贮存，贮存的方式和时间不应当对检定菌的 生长特性有不利影响。第4页
3、，本讲稿共20页二、验证目的m为了使微生物学检验方法的结果准确可靠，需要对每个品种的具体检验方法进行验证。第5页，本讲稿共20页三、验证概述m微生物学检验方法包括：m1.微生物限度检查m2.无菌检查m3.防腐剂抑菌效力测定总菌落数检查（回收率）总菌落数检查（回收率）控制菌检查（专属性）控制菌检查（专属性）第6页，本讲稿共20页三、验证概述m微生物学检验的影响因素：m1.药品本身的抑菌性m2.药品中防腐剂的抑菌性m3.培养基的促菌生长能力m4.培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧）m5.过滤系统的材质第7页，本讲稿共20页三、验证概述m消除抑菌性的方法:m一、化学中和法 用化学中和剂中和抑菌剂，消除
4、抑菌作用。m二、稀释法 降低抑菌剂的浓度以消除抑菌性。m三、薄膜过滤法 抑菌性产品通过滤膜时，微生物被截留在膜上，检品被过滤掉。微生物检查法准确与否的核心是对抑菌性的有效消除第8页，本讲稿共20页四、总菌落数检查方法验证m环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域m培养基种类：m细菌计数 营养琼脂培养基m霉菌和酵母菌计数 玫瑰红钠琼脂培养基m酵母菌计数 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基第9页，本讲稿共20页四、总菌落数检查方法验证m培养基适用性检查 被检培养基 培养结果 试验菌 试验菌 被检培养基上的菌落平均数不得小于对照培养基上的菌落平均数的70%菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致50100
5、cfu50100cfu适宜培养条件.第10页，本讲稿共20页四、总菌落数检查方法验证m方法验证对细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：进行3次独立的平行试验，分别计算各组回收率。（1）试验组 平皿法计数 薄膜过滤法计数 最低稀释级供试液1ml +2个琼脂培养基平皿 试验菌50100cfu取规定量的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加试验菌50100cfu，过滤。第11页，本讲稿共20页四、总菌落数检查方法验证（2）菌液组 直接接种试验菌（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。（4）稀释剂对照组 用相应的稀释剂代替供试品，加入试验菌。（若供试液制备需要分散
6、、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，需增加稀释剂对照组。）第12页，本讲稿共20页四、总菌落数检查方法验证m合格标准：m在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。m试验组的菌数回收率均不低于70%第13页，本讲稿共20页五、控制菌检查方法验证m环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域m培养基和培养基试验：m无菌性m促生长能力在最短时间内观察到明显生长m抑制能力在培养的最长时间内不能观察到微生物的生长m指示能力在规定的时间内必须和以前检验过并已接受的培养基在外观和指示反应都具备可比性。第14页，本讲稿共20页
7、五、控制菌检查方法验证m方法验证：m按照各品种项下规定检查的控制菌选择验证菌株。m规定量供试液+10100cfu试验菌+增菌培养基m合格标准：检出试验菌第15页，本讲稿共20页六、无菌检查方法验证m环境条件：B级下的局部A级的单向流空气区域m培养基：m硫乙醇酸盐流体培养基m改良马丁培养基第16页，本讲稿共20页六、无菌检查方法验证m培养基的适用性检查：m无菌性每批培养基随机取不少于5支，培养14天，应无菌生长。m灵敏度（菌液的制备见药典附录）指定培养基 指定培养基 各试验菌 空白对照：适宜条件培养后，空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。第17页，本
8、讲稿共20页六、无菌检查方法验证m方法验证：m菌种及菌液的制备见药典附录m测定方法：薄膜过滤法、直接接种法（1）薄膜过滤法：取规定量的供试品按薄膜过滤法过滤、冲洗，在最后一次的淋洗液中加小于100cfu的试验菌，过滤。取出薄膜接种至适宜培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取以装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定条件下培养。第18页，本讲稿共20页六、无菌检查方法验证m测定方法：薄膜过滤法、直接接种法（续）（2）直接接种法：各试验菌 置规定条件下培养。各试验菌+供试品m合格标准：供试品各容器中的试验菌生长良好。第19页，本讲稿共20页EndThankyou第20页，本讲稿共20页