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1、微生物检验方法验证方案 微生物限度检查方法（平皿法） 验证方案 目录 一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1验证目的和原理 2验证方法步骤 3试验实施 3.1试验前的准备 3.2验证试验操作 3.3试验结果 4验证结果评价分析 5附件 微生物限度检查方法（平皿法）验证文件一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 1验证方案的起草 2验证方案的审核与批准 验证方案审核人：审核日期：年月日验证方案批准人：批准日期：年月日三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1验证目的和原理 1.1 验证目的 为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵
2、母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。 1.2 原理 通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。 2验证方法步骤 2.1验证前的准备进行微生物限度检查方法（平皿法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。 2.2验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。 2.3试验结果
3、可接受标准用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。 3试验实施 3.1试验前的准备 3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化工作台、生物安全柜、 恒温培养箱、霉菌培养箱。 3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或防置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于 4.9pa。 3.1.3试验样品：尿素维生素E乳膏： 批号批号批号 3.1
4、.4稀释液和试剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无菌十四烷酸异丙酯3.1.5器具无菌培养皿：（直径90mm）无菌移液管（5ml） 3.1.6验证用微生物名称及其编号 实验菌株的来源： 编号由菌名首字母传代代数制备日期组成 3.1.7培养基 3.2验证试验操作 3.2.1试验菌的制备和稀释 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在3035下培养1824小时，将白色念珠菌接种至良马丁流体培养基中，2328下培养2448小时。将黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基中，在2328下培养57天小时。将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含 菌落数为50100c
5、fu的菌悬液。 3.2.2用不同类别的微生物考察供试液及检验程序的抑菌性，将试验分为4组 A样品试验组准确取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇510分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。 用移液管准确吸取1.0ml供试液至平皿中；并在每个平皿中接种50100cfu试验菌，立即倾注营养琼脂培养基，每个试验菌平行接种2个平皿，按照平皿法测定其菌数。 B菌液组在平皿中注入1ml的菌液立即倾注营养琼脂培养基，以测定所加的菌数。 C供试品对照组取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品的本底菌数。 D稀释剂对照组取相应稀释液1ml加入试验菌，使最终菌浓度为每ml供试液含50100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。 3.2.3培养将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在3050下培养48小时将白色念珠菌、黑曲霉在2328下培养72小时，点计菌落数。并将结果记录于附件1。 3.3试验结果 3.3.1稀释剂对照组菌的回收率