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1、第十章第十章 微生物的分类和鉴定微生物的分类和鉴定 v第一节第一节 通用分类单元通用分类单元v第二节第二节微生物在生物界的地位微生物在生物界的地位v第三节第三节微生物分类鉴定的方法微生物分类鉴定的方法微微生生物物分分类类学学（Microbial taxonomy）是是一一门门按按微微生生物物的的亲亲缘缘关关系系，把把其其安安排排成成条条理理清清楚楚的的各各种种各各类类单单元元或或分分类类群群的的科科学学,包包括括分分类类（Classification）、鉴鉴定定（Identification）、命名（命名（Nomenclature）第一节第一节 通用分类单元通用分类单元 v一一种以上的系统分类
2、单元种以上的系统分类单元v二二学名学名v三三亚种以下的几个分类名词亚种以下的几个分类名词一、一、种以上的系统分类单元种以上的系统分类单元（一）（一）七级分类单元：七级分类单元：界界（Kingdom）、门门（Phylum）、纲纲（Class）、目目（Order）、科科（Family）、属属（Genus）、种（种（Species）（二）种的概念：（二）种的概念：具具体体的的种种应应具具有有相相同同的的祖祖先先和和相相同同或或相相似似的的形形态态、生生理理特特征征，在在特特定定的的环环境境条条件件下下具具有有相对的稳定性和一定范围内的变异性。相对的稳定性和一定范围内的变异性。一一个个种种只只能能用用
3、该该种种中中的的一一个个典典型型菌菌株株作作为为具具体代表体代表,称为模式种或是模式标本称为模式种或是模式标本群：群：growseriesE.Scherichia coli 与与 Aerobacter 归归为为Coliformgroup。两两种种以以上上及及其其过过渡渡类类型型分归为一个群（一组具有相同性状的生物）分归为一个群（一组具有相同性状的生物）变变种种(Variety)：发发生生变变化化了了的的种种称称为为变变种种，具有典型的不同特征，且可以稳定遗传。具有典型的不同特征，且可以稳定遗传。如如BacillusSubtilisVarasporous 二、学名二、学名 （一）（一）微生物通常
4、采用双命名法。微生物通常采用双命名法。学学名名有有属属名名和和种种名名加加词词构构成成,用用斜斜体体表表示示。属属名名在在前前,而而且且第第一一个个字字母母大大写写,种种名名在在后后,全全部部小小写写。学学名名可可以以附附上上首首个个命命名名者者的的名名字字、现名定名人和现名的定名时间。现名定名人和现名的定名时间。学学名名=属属名名+种种名名加加词词+首首次次定定名名人人+现现名名定定名名人人+现名定名年份现名定名年份v如如:Staphylococcus aureusRosenbach1884（金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）Escherichia coli（Migula）Castellani
5、etChalmers1919（大肠埃希氏菌）（大肠埃希氏菌）vClostridium acetobutylicum Mccoy，Fred，Peterson et Hastings 1926（丙丙酮丁醇梭菌）酮丁醇梭菌）（二）三名法（二）三名法当某微生物是一个亚种（当某微生物是一个亚种（subspecies简称简称“subsp”）或变种（）或变种（variety简称简称“var”）时，）时，学名就应按三名法拼写。学名就应按三名法拼写。学名学名=属名属名+种名加词种名加词+subsp（var）+亚种亚种（变种）的加词（变种）的加词如：如：Bacillus thuringiensis（subsp）g
6、alleria（苏云金芽孢杆菌醋螟亚种）（苏云金芽孢杆菌醋螟亚种）Saccharomyces cerevisiae（var）ellipsoideus（酿酒酵母椭圆变种）（酿酒酵母椭圆变种）三、亚种以下的几个分类名词三、亚种以下的几个分类名词亚种：指除某一明显稳定的特征外，其余鉴定特亚种：指除某一明显稳定的特征外，其余鉴定特征都与模式种相同的种。征都与模式种相同的种。变种：亚种的同义词。变种：亚种的同义词。型：曾用做菌株的同义词，仅用做若干型的后缀，型：曾用做菌株的同义词，仅用做若干型的后缀，如生物变异型、形态变异型、致病变异型及血如生物变异型、形态变异型、致病变异型及血清变异型等清变异型等菌株
7、：又称品系，表示任何由一个独立分离的菌株：又称品系，表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯遗传型群体及其一切后单细胞繁殖而成的纯遗传型群体及其一切后代。代。第二节第二节微生物在生物界的地位微生物在生物界的地位v一一生物的界级分类学说生物的界级分类学说v二二三域学说及其发展三域学说及其发展一一生物的界级分类学说生物的界级分类学说两界系统：植物界和动物界两界系统：植物界和动物界三界系统：增加第三界三界系统：增加第三界原生生物界原生生物界四界系统：植物界、动物界、原始生物界（原生四界系统：植物界、动物界、原始生物界（原生动物、真菌、部分藻类等）及菌界（细菌、蓝细动物、真菌、部分藻类等）及菌界（细
8、菌、蓝细菌等）菌等）三总界五界系统三总界五界系统五界系统：包括动物界、植物界、原生生物界五界系统：包括动物界、植物界、原生生物界（原生动物、单细胞藻类及粘菌等）、真菌界（原生动物、单细胞藻类及粘菌等）、真菌界和原核生物界。和原核生物界。纵向显示从原核生纵向显示从原核生物向真核单细胞生物向真核单细胞生物再向真核多细胞物再向真核多细胞生物的三个近化阶生物的三个近化阶段；段；横向则显示光合式横向则显示光合式营养、吸收营养和营养、吸收营养和摄食营养三大进化摄食营养三大进化方向。方向。v六界系统六界系统v后生动物界、后生植物界、真菌界、原生生后生动物界、后生植物界、真菌界、原生生物界、原核生物界和病毒界
9、等物界、原核生物界和病毒界等二二三域学说及其发展三域学说及其发展v三个域指的是细菌域、古生菌域和真核生物三个域指的是细菌域、古生菌域和真核生物域等域等第四节第四节微生物分类鉴定的方法微生物分类鉴定的方法v一一微生物分类鉴定中的经典方法微生物分类鉴定中的经典方法v二二微生物分类鉴定中的现代方法微生物分类鉴定中的现代方法一一微生物分类鉴定中的经典方法微生物分类鉴定中的经典方法一）经典的微生物鉴定指标一）经典的微生物鉴定指标1、形态特征：、形态特征：1）群群体体形形态态特特征征：菌菌落落的的形形态态、在在半半固固体体培培养养基基或液体培养基中的生长状态。或液体培养基中的生长状态。2）个个体体特特征征
10、：显显微微镜镜观观察察其其形形态态或或是是染染色色后后再再观观察察，包包括括细细胞胞形形状状、大大小小、排排列列形形式式、运运动动性性、特殊构造和染色反应等特殊构造和染色反应等。2、生理生化特征：、生理生化特征：1）对对营营养养的的要要求求：如如能能源源、碳碳源源、氮氮源源、生生长长因因子等的要求。子等的要求。2）代代谢谢反反应应（酶酶）：水水解解大大分分子子的的能能力力（淀淀粉粉、油油脂脂、明明胶胶等等）、分分解解糖糖或或醇醇类类产产酸酸和和产产气气、硝硝酸盐还原试验等。酸盐还原试验等。3）代代谢谢产产物物：包包括括产产物物的的种种类类和和数数量量等等，通通过过颜颜色和显色反应等检测。色和显
11、色反应等检测。4）抗抗逆逆性性试试验验：对对包包括括温温度度、pH、药药物物等等的的抗抗性。性。3、生态特征：微生物与溶解氧的关系、对温度、生态特征：微生物与溶解氧的关系、对温度、渗透压、渗透压、盐度盐度及及pH等的要求、与其他生物之间的相等的要求、与其他生物之间的相互关系等。互关系等。4、生活史：繁殖方式、生长周期等、生活史：繁殖方式、生长周期等5、抗原特征：通过血清学反应检测。、抗原特征：通过血清学反应检测。6、对噬菌体的敏感性、对噬菌体的敏感性7、其他：氨基酸顺序、其他：氨基酸顺序 蛋白质分析蛋白质分析 细胞壁等细胞成分分析细胞壁等细胞成分分析生理生化特征生理生化特征在以实用为主要目的表
12、型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。肠杆菌肠杆菌柠檬酸杆菌柠檬酸杆菌沙门氏菌沙门氏菌志贺志贺氏菌氏菌二二）微生物的微型、简便、快速或自动化鉴定）微生物的微型、简便、快速或自动化鉴定技术。技术。1API细菌数值鉴定系统：同时鉴定细菌数值鉴定系统：同时鉴定20项以上项以上生化指标，因而可用作为快速鉴定细菌。生化指标，因而可用作为快速鉴定细菌。一种长形卡片，其上整齐地排列着一种长形卡片，其上整齐地排列着20个小塑个小塑料管，其中加有适量糖类等生化反应底物的料管，其中加有适量糖类等生化反应底物的干粉和反应产物的显色剂。干粉和反应产物的显色剂。API
13、 细菌数值鉴定系统细菌数值鉴定系统 适用于适用于APIAPI鉴定细鉴定细菌有菌有700700多种多种菌悬液菌悬液菌种菌种基本培养基基本培养基（液体）（液体）检测、编码、查表、鉴定检测、编码、查表、鉴定2Enterotube系统系统又称肠管系统。一种用一条有又称肠管系统。一种用一条有812个分隔小室的个分隔小室的划艇形塑料管制成，面上有塑料膜覆盖，可防止杂划艇形塑料管制成，面上有塑料膜覆盖，可防止杂菌污染。每个小室中装有鉴定不同生化反应的固体菌污染。每个小室中装有鉴定不同生化反应的固体培养基，通过将小室中的金属丝接触菌落，从对侧培养基，通过将小室中的金属丝接触菌落，从对侧将金属丝拉出以接种。将金
14、属丝拉出以接种。3Biolog全自动和手动细菌鉴定系统全自动和手动细菌鉴定系统适用于动植物检疫，临床和兽医的检验，食品、饮适用于动植物检疫，临床和兽医的检验，食品、饮用水卫生的监控、药物生产等。用水卫生的监控、药物生产等。关键部件为一块有关键部件为一块有96孔的细菌培养板，其中孔的细菌培养板，其中95孔孔中各加有氧化还原指示剂和不同的发酵性碳源的中各加有氧化还原指示剂和不同的发酵性碳源的培养基干粉，另一孔为清水对照。鉴定前，将待培养基干粉，另一孔为清水对照。鉴定前，将待检纯种微生物制成适当浓度的悬液，接种于检纯种微生物制成适当浓度的悬液，接种于96孔孔中，于中，于37培养培养424h，将培养板
15、放进检查室用，将培养板放进检查室用分光光度计检测，再通过计算机统计即可计算该分光光度计检测，再通过计算机统计即可计算该菌株属于何种微生物。菌株属于何种微生物。BiologBiolog全自动或手动细菌鉴定系统全自动或手动细菌鉴定系统 v在在96孔的细菌培养板上检测微生物对孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。可鉴定细菌有可鉴定细菌有11401140多多种、酵母菌种、酵母菌267267种、目前种、目前已经可用于丝状真菌已经可用于丝状真菌。每个孔中含有每个孔中含有不同的底物不同的底物菌悬液或菌悬液或无菌水无菌水自动化、快速自动化、快速
16、二二微生物分类鉴定中的现代方法微生物分类鉴定中的现代方法（一）（一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型通过核酸分析鉴定微生物遗传型1DNA碱基比例的测定：即碱基比例的测定：即“G+C”百分含量，表百分含量，表示示DNA分子中鸟嘌呤和胞嘧啶所占的摩尔百分比分子中鸟嘌呤和胞嘧啶所占的摩尔百分比值。值。（G+C）mol%=*100%每个生物种都有特定的每个生物种都有特定的GC%范围，因此范围，因此 可以作为可以作为分类鉴定的指标。细菌的分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为范围为25-75%，变化范，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。v通过多种生物的通过多种生物的G
17、C比后，可以发现：亲缘关系相比后，可以发现：亲缘关系相近的种，其基因组中核酸序列相近，故两者的近的种，其基因组中核酸序列相近，故两者的GC比也越接近；比也越接近；GC比差距大的两种微生物亲缘关系比差距大的两种微生物亲缘关系远；远；GC比是建立新分类单元时的可靠指标。比是建立新分类单元时的可靠指标。v测定测定DNA中的中的GC比的方法很多，其中解链温度比的方法很多，其中解链温度（Tm）法常用，其具有简单易操作、重复性好的）法常用，其具有简单易操作、重复性好的优点。优点。同一个种内的不同菌株同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在含量差别应在45%以下；同属不同种的差别应低于以下；同属不同种的差别应
18、低于1015%；G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。意义。若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其菌株，如果其G+C含量的差别大于含量的差别大于5%，则肯定不是，则肯定不是同一个种，大于同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。则肯定不是同一个属。2.核酸的分子杂交核酸的分子杂交按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条不同的单按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条不同的单链核酸进行复性，以构建新的杂交双链
19、核酸的技术，链核酸进行复性，以构建新的杂交双链核酸的技术，称为核酸杂交。称为核酸杂交。此法可用于此法可用于DNA-DNA、DNA-rRNA、rRNA-rRNA分子间的杂交。分子间的杂交。分子杂交是测定核酸分子同源程度和不同物种间亲缘分子杂交是测定核酸分子同源程度和不同物种间亲缘关系的有效手段关系的有效手段 不同生物不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。t 直接分析比较直接分析比较DNA的碱基排列顺序的碱基
20、排列顺序-由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；t 核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生间接比较不同微生物物DNA碱基排列顺序的相似性碱基排列顺序的相似性1）DNA-DNA杂交；杂交；（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）2）DNA-rRNA杂交；杂交；3）核酸探针；）核酸探针；（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）4）电子杂交）电子杂交 随
21、着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。的亲缘关系。3rRNA寡核苷酸编目（寡核苷酸编目（oligonucleotidecatalog）分析）分析 一种通过分析原核或是真核细胞中最稳定的一种通过分析原核或是真核细胞中最稳定的rRNArRNA寡核苷酸序列同源性程度，以确定不同寡核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。生物间的亲缘关系和进
22、化谱系的方法。选用选用16srRNA或或18srRNA作生物进化和系统作生物进化和系统分类研究有以下优点：分类研究有以下优点：rRNA普遍存在于真核和原核微生物的细普遍存在于真核和原核微生物的细胞中，应用广；胞中，应用广；它们的生理功能既重要又恒定；在细胞它们的生理功能既重要又恒定；在细胞中的含量高、较易提取；中的含量高、较易提取；编码编码rRNA的基因十分稳定；的基因十分稳定；v基本原理：利用一种基本原理：利用一种RNA酶水解酶水解rRNA后，后，可产生一系列寡核苷酸片段，如果两种或两可产生一系列寡核苷酸片段，如果两种或两株微生物的亲缘关系接近，则其所产生的寡株微生物的亲缘关系接近，则其所产
23、生的寡核苷酸片段的序列就越接近。核苷酸片段的序列就越接近。16S、18S RNArRNA寡核苷酸编目分析的方法：寡核苷酸编目分析的方法：v用用32P标记的被测菌株标记的被测菌株rRNA提纯；提纯；v用专一水解用专一水解G上上3端磷酸脂键的端磷酸脂键的T1RNA酶进行水解，酶进行水解，产生一系列以产生一系列以G为末端的长度不一的寡核苷酸片段；为末端的长度不一的寡核苷酸片段；v双向电泳分离，再用放射自显影技术获得双向电泳分离，再用放射自显影技术获得rRNA寡寡核苷酸群的指纹图谱；核苷酸群的指纹图谱；v分析图谱中链长在分析图谱中链长在6个核苷酸以上的寡核苷酸作序个核苷酸以上的寡核苷酸作序列；列；v按
24、不同长度进行编目、列表；按不同长度进行编目、列表；v通过比较、计算和分析，就可定量地知道被测菌株通过比较、计算和分析，就可定量地知道被测菌株间地亲缘关系间地亲缘关系。v4微生物全基因组序列的测定微生物全基因组序列的测定v通过测定微生物的全基因组，绘制图谱，分通过测定微生物的全基因组，绘制图谱，分析比较微生物间的关系。析比较微生物间的关系。二）细胞化学成分用作鉴定指标二）细胞化学成分用作鉴定指标1细胞壁的化学成分：细胞壁的化学成分：原核微生物细胞壁成分的分析，对菌种鉴定有原核微生物细胞壁成分的分析，对菌种鉴定有一定的作用。一定的作用。肽聚糖短肽尾的第三位氨基酸的不同：肽聚糖短肽尾的第三位氨基酸的
25、不同：赖氨酸；赖氨酸；内消旋二氨基庚二酸；内消旋二氨基庚二酸；L-DAPL-DAP；2全细胞水解液的糖型：全细胞水解液的糖型：放线菌全细胞水解液可分为放线菌全细胞水解液可分为4类主要糖型，阿类主要糖型，阿拉伯糖、半乳糖，如诺卡氏菌；马杜拉糖，拉伯糖、半乳糖，如诺卡氏菌；马杜拉糖，如马杜拉放线菌属；无糖，如高温放线菌属；如马杜拉放线菌属；无糖，如高温放线菌属；木糖、阿拉伯糖，小单胞菌属。木糖、阿拉伯糖，小单胞菌属。v3磷酸类脂成分的分析：位于细菌、放线菌磷酸类脂成分的分析：位于细菌、放线菌细胞膜上的磷酸类脂成分，在不同属中有所细胞膜上的磷酸类脂成分，在不同属中有所不同，可用于鉴别属的指标不同，可
26、用于鉴别属的指标。4枝菌酸：枝菌酸：不同微生物细胞的枝菌酸有所差别，碳不同微生物细胞的枝菌酸有所差别，碳原子数目有差异，可用于鉴别微生物。原子数目有差异，可用于鉴别微生物。5醌类的分析：醌类的分析：原核微生物有的含甲基萘醌（原核微生物有的含甲基萘醌（VK），），有的含泛醌，它们在放线菌鉴定上有一定的价值。有的含泛醌，它们在放线菌鉴定上有一定的价值。6气相色谱技术用于微生物鉴定：气相色谱技术用于微生物鉴定：分析微生物细分析微生物细胞和代谢产物中的脂肪酸和醇类等成分，对于厌氧胞和代谢产物中的脂肪酸和醇类等成分，对于厌氧微生物的鉴定具有实际意义。微生物的鉴定具有实际意义。（三）数值分类法：（三）数值
27、分类法：是一种依据数值分析的原理，是一种依据数值分析的原理，借助计算机技术对拟分类的微生物对象按大量表型性借助计算机技术对拟分类的微生物对象按大量表型性状的相似程度进行统计、归类的方法。状的相似程度进行统计、归类的方法。2.操作分类单位操作分类单位(operationtaxonomicunit)缩写为缩写为OTU,指分类研究的个体，细菌分类中一指分类研究的个体，细菌分类中一般是指菌株。般是指菌株。1.表观群表观群(phenon):2.表观群指建立在表面特征相似的基础上的类群，表观群指建立在表面特征相似的基础上的类群，一般是数值分类得到的类群。一般是数值分类得到的类群。计算两菌株间的相关系数计算
28、两菌株间的相关系数vSsm=Sj=上式中，上式中，a为两菌株均呈正反应的性状数，为两菌株均呈正反应的性状数，b为菌株为菌株甲呈正反应而乙呈负反应的性状数，甲呈正反应而乙呈负反应的性状数，c为菌株甲呈负为菌株甲呈负反应而乙呈正反应的性状数，反应而乙呈正反应的性状数，d为两菌株均呈负反应为两菌株均呈负反应的性状数的性状数列出相似度矩阵列出相似度矩阵将矩阵图转换成树状谱将矩阵图转换成树状谱end数值分类工作的程序数值分类工作的程序v1.选择菌株和待测性状选择菌株和待测性状v2.性状编码性状编码v3.相似性计算相似性计算v4.进行簇群分析进行簇群分析v5.分类结果的表示分类结果的表示选择菌株和待测性状
29、选择菌株和待测性状v拟测定的性状：包括形态、生理生化和生态等指拟测定的性状：包括形态、生理生化和生态等指标。标。待测菌株：包括相关已知种的模式菌株。待测菌株：包括相关已知种的模式菌株。菌株数目从几十到几百个，注意代表性。菌株数目从几十到几百个，注意代表性。性状编码性状编码v多态特征多态特征:则按相关规定将其分解为多个两态特征，则按相关规定将其分解为多个两态特征，或转换为二态特征。或转换为二态特征。两态特征两态特征:阳性结果记录为阳性结果记录为+，阴性为，阴性为-，输入计算，输入计算机时阳性是机时阳性是1，阴性用，阴性用0，资料缺失用，资料缺失用N表示。表示。将测得的性状状态记录转变成计算机能够
30、识别运算将测得的性状状态记录转变成计算机能够识别运算的符号。的符号。相似性计算相似性计算vSsm(匹配系数)v Ssm=(a+b)/(a+b+c+d)Sj=a/(a+b+c+d)v a：表示两个OTU性状编码皆为“1”的个数；v b：表示一个OTU为“1”，另一个OTU为“0”的性状个数；v c：表示一个OTU为“0”，另一个OTU为“1”的性状个数；v d：表示两个OTU皆为0的性状个数。根据性状测定结果计算出相似的系数，它是各个根据性状测定结果计算出相似的系数，它是各个OTUs之间相似程度的量值。之间相似程度的量值。进行簇群分析进行簇群分析v簇群分析也叫聚类分析簇群分析也叫聚类分析(clu
31、steranalysis)在考察各个在考察各个OTU之间的相似性后，按相似的大小之间的相似性后，按相似的大小进行分群分类，以揭示各个进行分群分类，以揭示各个OTU之间的相关性。之间的相关性。聚类分析分类结果的表示聚类分析分类结果的表示v矩阵图矩阵图是以不同阴影的方块代表不同的相似百分数。是以不同阴影的方块代表不同的相似百分数。v树状图树状图中最高的分枝表示相似值较高的簇群，往下中最高的分枝表示相似值较高的簇群，往下则为相似值较低的簇群，分类结构一目了然。通过对现则为相似值较低的簇群，分类结构一目了然。通过对现有已知种的描述和大量数据的调查，确定相似值有已知种的描述和大量数据的调查，确定相似值80%以以上的相当于种。上的相当于种。