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1、食品微生物检验一、微生物检测工作的意义n n据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，食源性疾病患者中，7070是由于食用了各种致病是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的。性微生物污染的食品和饮水造成的。20002000年至年至20022002年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况的监测结果表水产品、蔬菜中的致病菌污染状况的监测结果表明，明，微生物性食物中毒仍居首位微生物性
2、食物中毒仍居首位，占，占39.6239.62；化；化学性食物中毒占学性食物中毒占38.5638.56；动植物性和原因不明的；动植物性和原因不明的食物中毒均占食物中毒均占1010左右。左右。n n传统的微生物检测方法，主要包括形态检查和生化方法，传统的微生物检测方法，主要包括形态检查和生化方法，涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁多。工作繁多。n n19551955年德国学者年德国学者 发明了一种简单快速的大肠菌群快速检发明了一种简单快速的大肠菌群快速检测法测法纸片法纸片法纸片法纸片法，使原来的检测周期由，使原来的检测周期由7
3、272小时小时缩短到缩短到1515小时小时，材料成本降低了材料成本降低了四分之三四分之三，同时大大简化了操作程序。从，同时大大简化了操作程序。从此，这种生化检测方法开始发展起来。此，这种生化检测方法开始发展起来。n n另外，将培养基固化在试剂盒中的速测盒法，也是一种较另外，将培养基固化在试剂盒中的速测盒法，也是一种较为简洁快速的检测方法，省去了大量的实验准备工作。为简洁快速的检测方法，省去了大量的实验准备工作。二、开展微生物检测所需的基本条件n n无菌室（含无菌室（含紫外灯紫外灯等消毒设备的隔离空间）；等消毒设备的隔离空间）；n n恒温培养箱；恒温培养箱；n n微生物检测设备、器皿、试剂等；微
4、生物检测设备、器皿、试剂等；n n高压灭菌锅；（高压灭菌锅；（灭菌是否彻底灭菌是否彻底）n n具备以上设备和无菌操作概念即可进行检测了。具备以上设备和无菌操作概念即可进行检测了。灭菌彻底与否指示n n灭菌指示胶带（3M）n n生物指示（嗜热脂肪芽孢杆菌 121.1）紫外灯相关n n强度：对室内空气的消毒，直接照射法：采用室内悬吊式强度：对室内空气的消毒，直接照射法：采用室内悬吊式紫外线消毒时，室内安装紫外线消毒灯（紫外线消毒时，室内安装紫外线消毒灯（3030紫外灯，紫外灯，在在1.0m1.0m 处的强度处的强度 70W/cm270W/cm2）的数量为平均每立方米不）的数量为平均每立方米不少于少
5、于 1.5W1.5W，照射时间不少于，照射时间不少于30min30min。n n更换频率：紫外线灯使用过程中其辐照强度逐渐降低，故更换频率：紫外线灯使用过程中其辐照强度逐渐降低，故应定期测定消毒紫外线的强度，一旦降到要求的强度以下应定期测定消毒紫外线的强度，一旦降到要求的强度以下时，应及时更换。时，应及时更换。紫外线消毒灯的使用寿命，即由新灯紫外线消毒灯的使用寿命，即由新灯的强度降低到的强度降低到70W/cm2 70W/cm2 的时间的时间(功率功率 30W)30W)，或降低到，或降低到原来新灯强度的原来新灯强度的 70%70%（功率（功率 3030）的时间，应不低于）的时间，应不低于 100
6、0h1000h。紫外线灯管有高硼玻璃和石英玻璃之分，由于高。紫外线灯管有高硼玻璃和石英玻璃之分，由于高硼玻璃的硼玻璃的UV254nmUV254nm紫外线透过率只有紫外线透过率只有50%50%左右，一般只左右，一般只有有10001000小时；石英是紫外线透过率最高的材料，普通石英小时；石英是紫外线透过率最高的材料，普通石英可以透过可以透过UV254UV254的的80%80%以上，石英玻璃紫外线灯寿命一般以上，石英玻璃紫外线灯寿命一般大于大于60006000小时，进口的紫外线灯可以到小时，进口的紫外线灯可以到8000h8000h以上，部分以上，部分厂家可以达到厂家可以达到12001200小时。小时
7、。n n紫外线强度计至少紫外线强度计至少1 1年标定年标定1 1次次 。紫外线辐照时间计算n n照射剂量和时间：不同种类的微生物对紫外线的敏感性不同，用紫外照射剂量和时间：不同种类的微生物对紫外线的敏感性不同，用紫外线消毒时必须使用照射剂量达到杀灭目标微生物所需的照射剂量。线消毒时必须使用照射剂量达到杀灭目标微生物所需的照射剂量。杀灭一般细菌繁殖体时，应使照射剂量达到杀灭一般细菌繁殖体时，应使照射剂量达到10 000W.s/cm210 000W.s/cm2；杀灭；杀灭细菌芽孢时应达到细菌芽孢时应达到100 000W.s/cm2100 000W.s/cm2；病毒对紫外线的抵抗力介于细；病毒对紫外
8、线的抵抗力介于细菌繁殖体和芽胞之间；真菌孢子的抵抗力比细菌芽孢更强，有时需要菌繁殖体和芽胞之间；真菌孢子的抵抗力比细菌芽孢更强，有时需要照射到照射到600 000W.s/cm2600 000W.s/cm2，但一般致病性真菌对紫外线的抵抗力比细，但一般致病性真菌对紫外线的抵抗力比细菌芽胞弱；在消毒的目标微生物不详时，照射剂量不应低于菌芽胞弱；在消毒的目标微生物不详时，照射剂量不应低于100 100 000W.s/cm2000W.s/cm2。辐照剂量是所用紫外线灯在照射物品表面处的辐照强。辐照剂量是所用紫外线灯在照射物品表面处的辐照强度和照射时间的乘积。因此，根据紫外线光源的辐照强度，可以计算度和
9、照射时间的乘积。因此，根据紫外线光源的辐照强度，可以计算出需要照射的时间。例如，用辐照强度为出需要照射的时间。例如，用辐照强度为 70W/cm2 70W/cm2 的紫外线表面的紫外线表面消毒器近距离照射物品表面，选择的辐照剂量是消毒器近距离照射物品表面，选择的辐照剂量是 100 000W.s/cm2100 000W.s/cm2，则需照射的时间是：则需照射的时间是：100 000W.s/cm2 70W/cm2=1429 s 60s 100 000W.s/cm2 70W/cm2=1429 s 60s 24min24min。1、概念的理解n n无菌是指物体中没有活的微生物存在。n n防止微生物进入人
10、体或物体的操作方法，称为无菌技术或无菌操作。n n关键点：n n人：操作前洗手更衣等n n物：试剂器械n n环境：无菌室三、无菌操作和注意事项四、革兰氏染色n n革兰氏染色革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，染色法，18841884年由年由丹麦丹麦医师、细菌学家医师、细菌学家 Christain Christain GramGram创立。创立。n n步骤：步骤：a.a.将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染染1min1min，水洗。，水洗。n nb.b.滴加革兰氏碘液，作用滴加革兰氏碘液，作用lminlmin，水洗。
11、，水洗。n nc.c.滴加滴加95%95%乙醇脱色约乙醇脱色约15-30s15-30s，直至染色液被洗，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。掉，不要过分脱色，水洗。n nd.d.滴加复染液，复染滴加复染液，复染lminlmin，水洗、待干、镜检。，水洗、待干、镜检。n n原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做两大类，前者叫做革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌（G+G+），后者
12、为），后者为革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌（G G）。）。G G菌：细胞壁厚，肽菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物碘复合物在细胞膜上。呈紫色。在细胞膜上。呈紫色。GG菌：肽聚糖层薄，交联菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。细胞壁，番红染液复染后呈红色。n n革兰氏阳性菌：葡萄
13、球菌属（主要是革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄金黄色葡萄球菌球菌）、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特氏菌等；革）、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特氏菌等；革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、沙门氏菌属、兰氏阴性菌：埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏志贺氏菌属菌属（痢疾杆菌等）、（痢疾杆菌等）、霍乱弧菌霍乱弧菌、副溶血性弧菌、副溶血性弧菌等。等。五、BSL简介n nbiology security level(BSL):biology security level(BSL):生物安全水平生物安全水平n n 根据所用病原微生物的危害程度、对人和动物的易感根据所用病原微生物的危害程度、对人和动物的易感性、气溶胶传播的可
14、能性、预防和治疗的可行性等因素，性、气溶胶传播的可能性、预防和治疗的可行性等因素，其实验室生物安全水平共分为四级，一级最低，四级最高。其实验室生物安全水平共分为四级，一级最低，四级最高。n n一级生物安全水平（一级生物安全水平（BSL-1BSL-1）：能够安全操作，对实）：能够安全操作，对实验室工作人员和动物无明显致病性的，对环境危害程度微验室工作人员和动物无明显致病性的，对环境危害程度微小的，特性清楚的病原微生物的生物安全水平。小的，特性清楚的病原微生物的生物安全水平。n n二级生物安全水平（二级生物安全水平（BSL-2BSL-2）：能够安全操作，对实）：能够安全操作，对实验室工作人员和动物
15、致病性低的，对环境有轻微危害的病验室工作人员和动物致病性低的，对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平。如：大肠埃希氏菌原微生物的生物安全水平。如：大肠埃希氏菌 n n 三级生物安全水平（三级生物安全水平（BSL-3BSL-3）：能够安全地从）：能够安全地从事国内和国外的，可能通过呼吸道感染，引起事国内和国外的，可能通过呼吸道感染，引起严严重或致死性重或致死性疾病的病原微生物工作的生物安全水疾病的病原微生物工作的生物安全水平。如：平。如：炭疽芽孢杆菌炭疽芽孢杆菌、鼠疫杆菌鼠疫杆菌、结核分枝杆结核分枝杆菌菌、狂犬病毒狂犬病毒 n n四级生物安全水平（四级生物安全水平（BSL-4BSL-4）：能
16、够安全地从）：能够安全地从事国内和国外的，能通过气溶胶传播，实验室感事国内和国外的，能通过气溶胶传播，实验室感染高度危险，染高度危险，严重危害人和动物生命和环境严重危害人和动物生命和环境的，的，没有特效预防和治疗方法没有特效预防和治疗方法的微生物工作的生物安的微生物工作的生物安全水平。与上述相近的或有抗原关系的，但尚未全水平。与上述相近的或有抗原关系的，但尚未完全认识的病原体也应在此种水平条件下进行操完全认识的病原体也应在此种水平条件下进行操作，直到取得足够的数据后，才能决定是继续在作，直到取得足够的数据后，才能决定是继续在此种安全水平下工作还是在低一级安全水平下工此种安全水平下工作还是在低一
17、级安全水平下工作。如：作。如：埃博拉病毒埃博拉病毒、马尔堡病毒马尔堡病毒、天花病毒天花病毒 六、提高检测速度的一些方法一、设备更新：n n移液管、吸球/移液器n n普通高压蒸汽灭菌器普通高压蒸汽灭菌器/全自动高压蒸汽灭菌器全自动高压蒸汽灭菌器n n搅拌器或匀浆机/拍击式均质器n n二、采用快速检测方法进行粗筛n n纸片法n n快速检测试剂盒测试片检测结果图像七、常见微生物检测设备Biolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计19731973种种微生物，涵盖了所有的人类、动物、植物病原菌以及食品和部分环境微生物，其中细菌234个属，1 226个种。Bi
18、olog全自动快速微生物鉴定仪 原理：原理：Biolog自动微生物分析系统主要根据细菌等9595种碳种碳源源的利用情况,配合四唑类显色物质进行鉴定。分子生物学细菌鉴定n n1.16S rRNA1.16S rRNA分析分析 n n2.2.特异片段扩增特异片段扩增n n3.DNA3.DNA指纹技术指纹技术 （RFLPRFLPDNADNA的限制的限制 性片段长度多态性性片段长度多态性 ,RAPD-RAPD-随机扩增多态性随机扩增多态性 )PCR仪BD Phoenix System“凤凰”全自动细菌/鉴定药敏系统 1 1概况概况19981998年年Becton Dickinson and Compan
19、yBecton Dickinson and Company公司公司PhonenixPhonenix全自动细菌鉴定药敏系统全自动细菌鉴定药敏系统原理 采用荧光增强原理与传统酶、底物生化呈色反应结合。（菌种库270种细菌）MicroScan微生物自动鉴定及药敏系统n n概况概况 MicroScanMicroScan自动细菌鉴定系统包括半自动系列自动细菌鉴定系统包括半自动系列AutoScan-4AutoScan-4以及全自动系列以及全自动系列Walkaway 40/96 Walkaway 40/96。是。是美国美国美国美国最最普遍使用的鉴定系列之一。普遍使用的鉴定系列之一。n n原理 将荧光物质均匀
20、地混在培养基中，菌种接种到鉴定板，通过检测荧光底物的水解、底物被利用后的pH变化，特殊代谢产物的生成和某些代谢产物的生成率来进行菌种鉴定。n n原理：采用传统生化反应，原理：采用传统生化反应，8 8进位数码鉴定及荧光分析相进位数码鉴定及荧光分析相结合。荧光分析是用荧光标记细菌表面特异酶的底物，经结合。荧光分析是用荧光标记细菌表面特异酶的底物，经细菌水解底物产生荧光来判断结果细菌水解底物产生荧光来判断结果Sensititre(自动荧光法微生自动荧光法微生物鉴定药敏分析系统物鉴定药敏分析系统）AutoReaderARIS（可以自动孵育）（可以自动孵育）VITEK VITEK-ATB(VITEK-ATB(半自动微生物鉴定和药敏系统半自动微生物鉴定和药敏系统)Vitek-AMSVitek-AMS（全自动细菌鉴定和药敏分析系统（全自动细菌鉴定和药敏分析系统 ）Vitek II Vitek II VIDAS原理：VIDAS(bioMerieux Vitek公司)是应用酶酶联免疫荧光联免疫荧光试验(ELFA)检测食品中的病原菌。即用荧光标记后的抗体检测特异性的抗原(沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、EColi O157和单核细胞增生李斯特氏菌)FDA认可使用的检测系统认可使用的检测系统 就到这里！谢谢大家！