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1、目的基因的制取新目的基因的制取新Company Logo第1页，本讲稿共60页Company Logo基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切切切接接接接转转转转增增增增检检检检第2页，本讲稿共60页Company Logovv确定其表达调控机制和生物学功能确定其表达调控机制和生物学功能确定其表达调控机制和生物学功能确定其表达调控机制和生物学功能vv建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细
2、胞）vv将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内 改良生物体的遗传性状改良生物体的遗传性状改良生物体的遗传性状改良生物体的遗传性状 前提：从生物体基因组中分离克隆目的基因前提：从生物体基因组中分离克隆目的基因基因工程三大用途基因工程三大用途基因工程三大用途基因工程三大用途第3页，本讲稿共60页Company Logo构建生物个体的基因文库。即将某生物体的全基因组分段克隆，构建生物个体的基因文库。即将某生物体的全基因组分段
3、克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；重组克隆；利用利用PCRPCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。隆表达。目的基因的克隆战略目的基因的克隆战略第4页，本讲稿共60页Company LogoC CC C PCRPCRPCRPCR法法法法B B B B cDNAcDNAcDNAcDNA法法法法A A A A 鸟枪法鸟枪法鸟枪法鸟枪法D D D D 化学合成法化学合成法化学合成法化学合成法E E E E 基因文库法基因文库法基因文
4、库法基因文库法第5页，本讲稿共60页Company Logo取细胞液取细胞液1.5mL1.5mL，4000r/min4000r/min离心离心10min10min；弃上清，加入弃上清，加入1.5mL TES1.5mL TES洗涤菌体细胞，洗涤菌体细胞，4000 r/min4000 r/min离心离心10min10min，弃上，弃上清液；清液；按按1mL/g1mL/g湿菌体的量加入湿菌体的量加入5 5倍体积预冷的蔗糖倍体积预冷的蔗糖TESTES溶液，冰浴中用玻溶液，冰浴中用玻璃棒使菌体细胞充分悬浮，加入溶菌酶至终浓度为璃棒使菌体细胞充分悬浮，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL1mg/mL，充分，充
5、分混匀，混匀，00反应反应151525min25min；加入加入EDTAEDTA至终浓度为至终浓度为0.1mol/L0.1mol/L，轻轻混匀，反应，轻轻混匀，反应10min10min；加入加入SDSSDS至终浓度为至终浓度为1 1（W/VW/V），轻轻混匀，室温下处理），轻轻混匀，室温下处理30min30min；加入等体积水饱和酚，轻轻上下倒置混匀约加入等体积水饱和酚，轻轻上下倒置混匀约5min5min，12000r/min12000r/min离心离心2min2min；基因组基因组DNADNA的提取的提取第6页，本讲稿共60页Company Logo用大口吸头吸取上层液体至另一用大口吸头吸取
6、上层液体至另一eppendorfeppendorf管。加入等体积水饱和酚，管。加入等体积水饱和酚，轻轻上下倒置混匀约轻轻上下倒置混匀约5min5min，于高速离心机中，于高速离心机中，12000r/min12000r/min离心离心2min2min；重复此步骤至溶液离心后无中间层；重复此步骤至溶液离心后无中间层；加入加入2.22.2倍体积预冷无水乙醇，倍体积预冷无水乙醇，2020下处理下处理30min30min，12000r/min12000r/min离离心心10min10min，弃上清液；，弃上清液；加入适量预冷加入适量预冷7070乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀DNADNA，离心，弃上清液，无菌状
7、态下挥，离心，弃上清液，无菌状态下挥干乙醇；干乙醇；加入加入50g/mL RNaseA50g/mL RNaseA，3737下处理下处理30min30min；将干燥后的将干燥后的DNADNA溶于溶于100L 0.2TE100L 0.2TE溶液中，分装后，置于溶液中，分装后，置于2020下保存备用。下保存备用。第7页，本讲稿共60页Company LogoA A 鸟枪法鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限
8、性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性第8页，本讲稿共60页Company Logo鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNADNADNA片段，然片段，然片段，然片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的含有目的基因的含有目的基因的含有目的基因的目
9、的重组子目的重组子目的重组子目的重组子，进而获得目的基因。，进而获得目的基因。，进而获得目的基因。，进而获得目的基因。适用于原核细菌目的基因的克隆分离适用于原核细菌目的基因的克隆分离适用于原核细菌目的基因的克隆分离适用于原核细菌目的基因的克隆分离 第9页，本讲稿共60页Company Logo鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体染色体染色体染色体DNADNADNADNA的切断的切断的切断的切断 与载体连接与载体连接与载体连接与载体连接 转化受体细胞转化受体细胞转化受体细胞转化受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子
10、筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞v超声波处理：片段长度均一
11、，大小可控，平头末端v全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大 小不可控 v部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整第10页，本讲稿共60页Company Logo鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体已知目的基因
12、两端的酶切口，可用该酶处理染色体已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNADNADNADNA，然后与载体拼接，然后与载体拼接，然后与载体拼接，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子目的重组子目的重组子目的重组子的出现频的出现频的出现频的出现频率率率率 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNADNADNA 第11页，本讲
13、稿共60页Company Logo 例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 1.8 1.8 1.8 kbkbkbkb的的的的SalISalISalISalI片段中，将染色体片段中，将染色体片段中，将染色体片段中，将染色体DNADNADNADNA用用用用SalISalISalISalI切开，切开，切开，切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于于于于1.6-2.0 1.6-2.0 1.6-2.0 1.6-2.0 kbkbkbkb大小
14、区域内的凝胶块，从大小区域内的凝胶块，从大小区域内的凝胶块，从大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收此凝胶块中回收此凝胶块中回收此凝胶块中回收DNADNADNADNA片段，然后与载体进片段，然后与载体进片段，然后与载体进片段，然后与载体进行拼接行拼接行拼接行拼接在连接前将在连接前将在连接前将在连接前将DNADNADNADNA片段进行分级分离片段进行分级分离片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进第12页，本讲稿共60页Company Logo冻融法冻融法冻融法冻融法吸附法吸附法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法低融点凝胶法低融点凝胶
15、法电洗脱法电洗脱法电洗脱法电洗脱法凝胶凝胶凝胶凝胶DNADNADNADNA片段回收技术片段回收技术片段回收技术片段回收技术 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进第13页，本讲稿共60页Company Logo工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子
16、结构鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性第14页，本讲稿共60页Company LogoB cDNAB cDNA法法cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序cDNAcDNA法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性第15页，本讲稿共60页Company Logo cDNA cDNA（complementary DNAcomplementary
17、DNA）：在特定的发）：在特定的发育时期，由生物的某一特定器官的细胞内的育时期，由生物的某一特定器官的细胞内的mRNAmRNA经经体外反录后形成的互补体外反录后形成的互补DNADNA。第16页，本讲稿共60页Company LogocDNAcDNAcDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略mRNAmRNAcDNAcDNAcDNAcDNA第一链的合成第一链的合成第一链的合成第一链的合成 55pppppp55GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 3355pppppp55GGAAAAAAAAAAAA
18、AAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTT pp 5555pppppp55GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTT pp 55cDNAcDNA第一链第一链第一链第一链引物引物引物引物退火退火退火退火逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPs第17页，本讲稿共60页Company LogocDNAcDNAcDNAcDNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成 煮沸煮沸煮沸煮沸NaOHNaOH自身引导法：自身引导法：自身引导法
19、：自身引导法：获得的双链获得的双链获得的双链获得的双链cDNA cDNA cDNA cDNA 5555端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55pppppp55GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOH 3OH 3K
20、lenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1第18页，本讲稿共60页Company LogoDNApol dNTPsDNApol dNTPsRNaesHRNaesH置换合成法：置换合成法：置换合成法：置换合成法：55pppppp55GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555 AAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
21、AAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5555AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3333T4-DNA ligaseT4-DNA ligasecDNAcDNAcDNAcDNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成 第19页，本讲稿共60页Company LogodCTPdCTPTdTTdT引导合成法：引导合成法：引导合成法：引导合成法：55pppppp55GGAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTp 5TTTTTp 533 HOHO55pppppp55GGAAAAACCCCCCCOH 3AAAAACCCC
22、CCCOH 333 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTp 5TTTTTp 533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTp 5TTTTTp 533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTp 5TTTTTp 555 ppGGGGGGGGGGGGGG3 HOCCCCCCC3 HOCCCCCCCTTTTTp 5TTTTTp 55 pGGGGGGG5 pGGGGGGGAAAAAOH 3AAAAAOH 3NaOHNaOH退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPscDNAcDNAcDNAcDNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成 第20页，本讲稿共60页
23、Company LogocDNAcDNAcDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略双链双链双链双链cDNAcDNAcDNAcDNA的克隆的克隆的克隆的克隆 双链平头的双链平头的双链平头的双链平头的cDNAcDNAcDNAcDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，平头末端直接与载体连接，平头末端直接与载体连接，平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收但插入的片段无法回收但插入的片段无
24、法回收但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，平头两端分别接同聚物尾，平头两端分别接同聚物尾，平头两端分别接同聚物尾，最好是最好是最好是最好是ATAT同聚物尾，这样重同聚物尾，这样重同聚物尾，这样重同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和组分子可通过加热局部变性和组分子可通过加热局部变性和组分子可通过加热局部变性和S1S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，加装人工接头引入酶切口，加装人工接头引入酶切口，加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收以便插入片段回收以便插入片段回收以便插入片段回收 第21页，本讲稿共
25、60页Company LogocDNAcDNAcDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序完备分离程序完备分离程序完备分离程序完备分离程序 提提提提取取取取细细细细胞胞胞胞总总总总mRNAmRNAmRNAmRNA，合合合合成成成成总总总总cDNAcDNAcDNAcDNA，将将将将之之之之全全全全部部部部克克克克隆隆隆隆，然然然然后后后后借借借借助助助助于于于于合合合合适适适适的的的的筛筛筛筛选选选选手段找到手段找到手段找到手段找到目的重组子目的重组子目的重组子目的重组子 筛筛筛筛选选选选时时时时，若若若若使使使使用用用用的的的
26、的是是是是多多多多拷拷拷拷贝贝贝贝载载载载体体体体，则则则则采采采采用用用用菌菌菌菌落落落落原原原原位位位位杂杂杂杂交交交交法法法法筛筛筛筛选选选选；若若若若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于完备分离程序适用于完备分离程序适用于完备分离程序适用于mRNAmRNAmRNAmRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛
27、素基因、干扰素基因、凝血因子干扰素基因、凝血因子干扰素基因、凝血因子干扰素基因、凝血因子VIIIVIIIVIIIVIII基因等基因等基因等基因等 第22页，本讲稿共60页Company Logo特异分离程序特异分离程序特异分离程序特异分离程序 提提提提取取取取细细细细胞胞胞胞总总总总mRNAmRNAmRNAmRNA，琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳分分分分离离离离，回回回回收收收收目目目目标标标标mRNAmRNAmRNAmRNA，由由由由此此此此合合合合成成成成双双双双链链链链cDNAcDNAcDNAcDNA，然后进行克隆然后进行克隆然后进行克隆然后进行克隆 特特特特异
28、异异异分分分分离离离离程程程程序序序序较较较较适适适适用用用用于于于于mRNAmRNAmRNAmRNA丰丰丰丰度度度度极极极极高高高高的的的的目目目目的的的的基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆如如如如血血血血红红红红蛋蛋蛋蛋白白白白基因等基因等基因等基因等 cDNAcDNAcDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序第23页，本讲稿共60页Company LogocDNAcDNAcDNAcDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的并非所有的并非所有的mRNA
29、mRNAmRNAmRNA分子都具有分子都具有分子都具有分子都具有polyApolyApolyApolyA结构结构结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNAmRNAmRNA半衰期很短半衰期很短半衰期很短半衰期很短 mRNA mRNA mRNA mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 第24页，本讲稿共6
30、0页Company LogoC PCRC PCR法法 PCR PCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）：又称为：又称为聚合酶链式反聚合酶链式反应应或或PCRPCR扩增技术扩增技术，是一种高效快速的体外是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序聚合程序 使用使用使用使用PCRPCRPCRPCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNADNADNADNA片段两侧的序列，根据该序
31、列化学合成聚合反应需的双引物片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应需的双引物片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应需的双引物片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应需的双引物 PCRPCRPCRPCR法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理第25页，本讲稿共60页Company Logo5555目的基因目的基因目的基因目的基因55变性变性变性变性加热加热加热加热5555引物引物引物引物退火退火退火退火5555底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合55555555加热加热加热加热变性变性变性变性5555555555555
32、5555555555555555555555555555555555555退火退火退火退火 引物引物引物引物底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合加热加热加热加热变性变性变性变性引物引物引物引物退火退火退火退火底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合112233第26页，本讲稿共60页Company Logo 由由由由Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCRPCRPCR产物中，其产物中，其产物中，其产物中，其3333末端总是会带有一个非模板依赖型末端总是会带有一个非模板依赖型末端总是会带有一个非模板依赖型末端总是会带有一个非模板依赖
33、型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是的突出碱基，而且这个碱基几乎总是的突出碱基，而且这个碱基几乎总是的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A AA A，因为因为因为因为Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶对聚合酶对聚合酶对聚合酶对dATPdATPdATPdATP具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdTTdTTdTTdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，末端加同聚尾的方法与载体拼接，末端加同聚尾
34、的方法与载体拼接，末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的也可以使用专门的也可以使用专门的也可以使用专门的T TT T载体载体载体载体克隆克隆克隆克隆 PCRPCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序5555AAAATTTT5555PCRPCR扩增产物扩增产物T T 载体载体T7T7lacZlacZMCSMCSorioriApAprr第27页，本讲稿共60页Company Logo温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）949472726060PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期循环循环循环循环1 1 循环循
35、环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3第28页，本讲稿共60页Company Logov特点特点v待扩增的待扩增的DNA链限定在模板上的退火位点之间链限定在模板上的退火位点之间v待扩增待扩增DNA链得到迅速大量扩增链得到迅速大量扩增v反应体系组成反应体系组成v影响因素影响因素v模板模板vdNTPvDNA聚合酶聚合酶v引物引物A、BvMgCl2v引物的设计引物的设计v退火温度退火温度vMgCl2浓度浓度第29页，本讲稿共60页Company LogoD 化学合成法化学合成法化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成的单元操作化学合成的单元操作DNADNA化学合成的用途化学合成的用途第30
36、页，本讲稿共60页Company Logo化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成全基因合成全基因合成化学合成目的基因的前提条件是化学合成目的基因的前提条件是化学合成目的基因的前提条件是化学合成目的基因的前提条件是基因的基因的基因的基因的DNADNADNADNA序列已知序列已知序列已知序列已知，有三种战略：，有三种战略：，有三种战略：，有三种战略：小片段粘接法：小片段粘接法：小片段粘接法：小片段粘接法：混合退火混合退火混合退火混合退火根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列
37、，分别合成12-1512-1512-1512-15bpsbpsbpsbps单链单链单链单链DNADNADNADNA小片段小片段小片段小片段T4-DNAT4-DNAT4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体 第31页，本讲稿共60页Company Logo化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成全基因合成全基因合成补钉延长法：补钉延长法：补钉延长法：补钉延长法：混合退火混合退火混合退火混合退火 根据目的基因两条互补链全序列，分别合成根据目的基因两条互补
38、链全序列，分别合成根据目的基因两条互补链全序列，分别合成根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-1512-1512-1512-15碱基长的单链碱基长的单链碱基长的单链碱基长的单链DNADNADNADNA小片小片小片小片段以及段以及段以及段以及20-3020-3020-3020-30碱基长的单链碱基长的单链碱基长的单链碱基长的单链DNADNADNADNA中片段中片段中片段中片段T4-DNAT4-DNAT4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenowKlenowKlenow酶聚合酶聚合酶聚
39、合酶聚合第32页，本讲稿共60页Company Logo化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成全基因合成全基因合成大片段酶促法：大片段酶促法：大片段酶促法：大片段酶促法：混合退火混合退火混合退火混合退火根据目的基因的全序列，分别合成根据目的基因的全序列，分别合成根据目的基因的全序列，分别合成根据目的基因的全序列，分别合成40-5040-5040-5040-50碱基长的单链碱基长的单链碱基长的单链碱基长的单链DNADNADNADNA片段片段片段片段T4-DNAT4-DNAT4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接连接酶连接连接酶连接
40、克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenowKlenowKlenow酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合第33页，本讲稿共60页Company Logo化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成全基因合成全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNADNADNADNA的单片段愈短，收率的单片段愈短，收率的单片段愈短，收率的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法就愈高，但由于化学
41、合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体
42、的产物收率为95%95%95%95%则合成则合成则合成则合成50505050个碱基长的个碱基长的个碱基长的个碱基长的DNADNADNADNA单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有7.7%7.7%7.7%7.7%第34页，本讲稿共60页Company Logo化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分序列，在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分序列，在某些情况下，往往只知道目
43、的基因编码产物的部分序列，在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测DNADNADNADNA序列，然序列，然序列，然序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或后合成探针，筛选由鸟枪法或后合成探针，筛选由鸟枪法或后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNAcDNAcDNAcDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基法得到的重组子，最终获得含有目的基法得到的重组子，最终获得含有目的基法得到的重组子，最终获得含有目的基因的因的因
44、的因的目的重组子目的重组子目的重组子目的重组子 由于大多数氨基酸拥有由于大多数氨基酸拥有由于大多数氨基酸拥有由于大多数氨基酸拥有简并密码子简并密码子简并密码子简并密码子，故在探针序列的设计时必须考，故在探针序列的设计时必须考，故在探针序列的设计时必须考，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：虑下列问题：虑下列问题：虑下列问题：生物体对简并密码子的生物体对简并密码子的生物体对简并密码子的生物体对简并密码子的偏爱性偏爱性偏爱性偏爱性，合成系列探针，合成系列探针，合成系列探针，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在
45、17-2017-2017-2017-20个核苷酸之间个核苷酸之间个核苷酸之间个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域探针内部不应出现可能的互补区域探针内部不应出现可能的互补区域探针内部不应出现可能的互补区域第35页，本讲稿共60页Company Logo化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleCys Met Asp Glu M
46、et Lys Arg Asn Ile所有可能的所有可能的所有可能的所有可能的DNADNADNADNA序列序列序列序列TGTTGTATGATGGACGACGAAGAAATGATGAAAAAAAGAAGAAACAACATAATA C T C T GGATG ATG GG G G T T T T C C CGA CGA CGG CGG CGT CGT CGC CGC设计的简并探针序列设计的简并探针序列设计的简并探针序列设计的简并探针序列TGTGT TATGATGGAGAC CGAGAI IATGATGAATGTGT TATGATGGAGAT TGAGAI IATGATGA ATGTGC CATGAT
47、GGAGACCGAGAI IATGATGA ATGTGC CATGATGGAGAT TGAGAIIATGATGA A A A G G 此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的ESTESTESTEST数据库进行倾向性简并序数据库进行倾向性简并序数据库进行倾向性简并序数据库进行倾向性简并序列设计列设计列设计列设计expressed sequence tagexpressed sequence tag第36页，本讲稿共60页Company Logo化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作 化化化化学学学学
48、合合合合成成成成DNADNADNADNA的的的的实实实实质质质质是是是是按按按按照照照照序序序序列列列列要要要要求求求求将将将将脱脱脱脱氧氧氧氧核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸单单单单体体体体一一一一个个个个个个个个接接接接上上上上去去去去，每每每每接接接接一一一一个个个个单单单单体体体体就就就就是是是是一一一一个个个个循循循循环环环环反反反反应应应应，包包包包括括括括：基基基基团团团团保保保保护护护护、分分分分离离离离、缩缩缩缩合合合合、分分分分离离离离、去保护去保护去保护去保护五大操作单元。五大操作单元。五大操作单元。五大操作单元。从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，从反应机理上
49、来讲，DNADNADNADNA化学合成有化学合成有化学合成有化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法酸液三酯法酸液三酯法酸液三酯法；具体操作过程又有；具体操作过程又有；具体操作过程又有；具体操作过程又有液相合成液相合成液相合成液相合成和和和和固相合成固相合成固相合成固相合成两种形式。前者操作两种形式。前者操作两种形式。前者操作两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，繁琐，基本上
50、已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNADNADNADNA合成仪就是合成仪就是合成仪就是合成仪就是根据根据根据根据固相亚磷酸液三酯法固相亚磷酸液三酯法固相亚磷酸液三酯法固相亚磷酸液三酯法原理设计的原理设计的原理设计的原理设计的第37页，本讲稿共60页Company LogoDMTDMT：二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作第38页，本讲稿共60页Company LogoDNADNA化学合成的用途化学合成的用途化学合成的用途化学合成的用途vv合成天然基因合成天然基因合成天然基因合成天然基因vv