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1、第十一讲目的基因的获得第1页，本讲稿共18页目的基因目的基因需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构和研究某基因结构和功能的关系功能的关系研究某基因与研究某基因与疾病的关系疾病的关系第2页，本讲稿共18页目的基因的获得目的基因的获得PCR化学合成法化学合成法 cDNA文库基因组DNA文库基因差异表达第3页，本讲稿共18页1 PCR技术获得目的基因1.1 已知序列基因的PCR扩增1.2 RT-PCR1.3 RACE(cDNA末端的快速扩增)第4页，本讲稿共18页1.1 已知序列基因的PCR扩增引物设计；引物效果检验和PCR参数确定。第5页，本讲稿共18页1.2 RT-PC
2、R原理：利用逆转录酶能将mRNA逆转录成cDNA的特性，通过合适的引物，将细胞内的mRNA逆转录成cDNA。然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。第6页，本讲稿共18页逆转录步骤cDNA 链合成：链合成：一般利用一般利用polyT作为引物，也可用特异性作为引物，也可用特异性的序列作为引物的序列作为引物G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAAReverse transcriptasemRNAcDNAT T A G G A GTTTTTTTTTTTTTTT逆转录polyT引物第7页，本讲稿共18页RT-PCR的优点：不需要纯化mRNA，总RNA就可以
3、作为合成单链cDNA的模板；单链cDNA合成后其3端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核酸，可得到相当于mRNA5末端的比较完整的序列。第8页，本讲稿共18页1.3 RACE 以mRNA为模板，反转录合成cDNA第一链，然后用PCR技术扩增从某个特定位点到3端或到5端之间的未知核苷酸序列。这里的3端和5端是针对mRAN而言。第9页，本讲稿共18页RACE的技术流程分析核心区段 经过比对分析，找出同源性较强的序列，然后根据核心序列设计引物。来源：蛋白质、cDNA 第10页，本讲稿共18页RACE的技术流程 设计简并引物和扩增核心区域 第11页，本讲稿共18页RACE的技术流程 设计RACE
4、引物并进行3RACE和5RACE 扩增的核心区域克隆和测序后，既获得目的基因中间部分的序列，根据这一序列分别设计RACE引物。3RACE：上游引物上游引物：根据中间核心序列设计 下游引物：下游引物：oligo（dT）利用cDNA第一链为模板将cDNA3端扩增出来 第12页，本讲稿共18页5RACE下游引物：根据核心序列设计上游引物：将mRNA5端的帽子结构切除，然后利用连接酶接上一段已知序列的寡核苷酸；特殊的反转录酶在cDNA末端加碱基；TdT的应用。第13页，本讲稿共18页2 根据基因差异表达获得目的基因DD-PCR（mRNA差异显示技术）：2.1 以锚定引物合成cDNA第一链Poly(A)
5、5上游的两个碱基只能有12种不同的组合。oligo(dTMN)（3端锚定引物）M=A、C、G N=A、G、C、T2.2 以5端随机引物和3锚定引物进行PCR 2.3 PAGE 2.4 回收差异条带，利用差异条带制备探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选。第14页，本讲稿共18页3 化学合成法获取目的基因 1979年，Khornan等首次用化学的方法合成了一种具有生物活性的大肠杆菌酪氨酸转移酶核糖核酸基因，开创了基因化学合成的先例。第15页，本讲稿共18页3.1 寡核苷酸单链的化学合成 主要做PCR引物、测序引物和PCR定点诱变3.2 探针的合成3.3 连接子和接头的合成3.4 基因的半合成3.5 全长基因的合成第16页，本讲稿共18页 目前，化学合成寡核苷酸片段的能力是150200bp，绝大数基因，尤其是高等生物的基因，大小超过这个范围。因此，要有适当的方法来获得完整的基因。第17页，本讲稿共18页思考题：目的基因的获得方式有哪些？第18页，本讲稿共18页