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1、 计划计划 实验七实验七 小鼠染色体制备与观察小鼠染色体制备与观察小鼠染色体制备与观察【实验目的】1.了解小白鼠睾丸细胞染色体的形态及数目。2.初步掌握小白鼠睾丸细胞染色体的玻片标本制作方法。3.观察动物细胞染色体的数目和形态。【实验原理】染色体是遗传物质的载体，它具有种属特异性，通常不同物种以不同亚种的核型是不同的。通过对各种动物染色体核型的研究可以丰富物种的信息系统，对了解物种的遗传变异进化以及物种的分类均有一定的意义。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。染色体的制备在原则
2、上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或、其它组织那样要经过体外培养;对大型动物通常采用对骨骼、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点:1.用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处;2.用低渗法使将细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上;3.空气干
3、燥法可使使细胞的染色体在载片上展平,经 Giemsa 染色后便可观察到染色体的显微图象。制作染色体标本的先决条件1.细胞具有旺盛的分裂能力选择活跃的组织:胸腺，骨髓，睾丸，小肠施加药物使细胞分裂:PHA2.设法得到大量的中期细胞:秋水仙素A(PHA:粗细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞B(秋水仙素:破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期。C(低渗作用:水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间的距离拉大，易于染色体展开D(空气干燥:使细胞和染色体展开E(固定:用甲醇:冰醋酸=3:1 作用使蛋白质变性，对染色体内的组蛋白讲，变性后硬度增加，保持了染色体的“及时形态”，对细胞
4、膜蛋白讲，变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。染色体组型又名核型，是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染色体特征。进行染色体组型主要依据有以下几个参数:1.相对长度(relative length):指单个染色体的长度与包括 X 染色体在内的单倍体染色体总长度之比，相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X 染色体)的总长度100%。2.臂指数(arm index):指染色体长臂与短臂的比率，臂指数=长臂/短臂。3.着丝粒指数(centromere index):指短臂
5、占整个染色体长度的比率，着丝粒指数=短臂/整个染色体长度100%,该比率决定了着丝粒在染色体中的相对位置。4.染色体的臂数:对于端部着丝粒染色体，臂数为 1，其它为 2。根据Levan(1964)所制定的人类染色体标准，臂指数在 1.01.7 之间的染色体为中央着丝粒染色体，在 1.73.0 之间为亚中央着丝粒染色体，在 3.07.0 间为亚端部着丝粒染色体，大于 7.0 为端部着丝粒染色体;着丝粒指数在 50.037.5 之间的染色体为中央着丝粒染色体，在 37.525.0 之间为亚中央着丝粒染色体，在 25.012.5 之间为亚端部着丝粒染色体，小于 12.5 为端部着丝粒染色体。【实验材
6、料】1.材料:小白鼠。2.试剂:秋水仙素、0.3%KCl 溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆萨原液。3.器械:手术刀、手术剪、镊子、试管架、解剖盘、注射器、针头、吸管、离心管、离心机、玻片(冰片)、天平、试镜纸、吸水纸、烧杯、水浴锅。【实验步骤】1.取雄性小鼠以每克体重 4ug 注射秋水仙素，经 14-16 小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸，用生理盐水(0.9%的 NaCl)吸去血污。2.放入装有 1ml 0.3%KCl 液的小烧杯中剪碎(呈乳白色)。3.用铜网过滤到刻度离心管中，再加 0.3%KCl 液至 4ml。4.37?静置 30 分钟，进行低渗处理。5.以 800-1000 转/分 离心 8 分
7、钟。6.弃上清液，加入 2ml 甲醇、冰醋酸固定液(3:1)，并用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定 8min。7.再以 800-1000 转/分，离心 8min。8.弃上清液，加 1ml 固定液，制成细胞悬液，固定 5min。9.取洁净的低温预冷载玻片，距 10-15cm 高度滴下 2-3 滴细胞悬液，从一边轻轻吹气，并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。10.用滤纸擦去载玻片上多余液体，空气干燥或文火干燥，染色。【实验结果】第一张标本观察结果如下:图一 染色体制片一观察(10 x40)第二张标本观察如下:图二 染色体制片二观察(10 x40)一张标本的普遍染色体没有展开，中期的较少，
8、实验未找到恰好处于中期的染色体，由于细胞间期时间长，中期时间短，所以多为近中期细胞染色体;并且视野中都是细胞碎片，染色体大多聚集在一起，说明没有“摔”好，染色体还没有分开。第二张图片应靠近中期，基本完全展开。【实验结果分析与注意事项】镜检的结果为:所观察到的染色体条数为 40 条。1.在实验中造成染色体标本制作不佳的原因有:秋水仙素用量太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解;低渗处理不好。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂;低渗不足则染色体在一起，分散不开;离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过
9、长，则会引起细胞破裂;反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失;固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响;载玻片有油脂或冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展;用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失;滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂;过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。2.本实验中，对由小鼠精巢而来的染色体标本进行镜检时,发现染色体数有的为 40 条，而有的则为 20 条，为什么,拥有 20 条染色体的单倍体细胞会是什么细
10、胞,有 40 条染色体的可能是小鼠的体细胞、精原细胞。有 20 条染色体的可能是已完成第一次减数分裂的精细胞或精子。之所以同时出现 40 条和 20 条染色体，是因为精巢里存在大量正在进行有丝分裂和减数分裂的细胞，用秋水仙素处理后，所有细胞均停止分裂。【注意事项】1.有足够量的细胞，在处理小鼠的睾丸时，尽量不要留下较大的组织块，那样会使单个细胞较少，不利于观察2.滴片时注意，保持一定高度，准确滴在玻片上，不能重叠，用嘴向一个方向吹气(避免用力，否则会被吹到一端)，有助于染色进一步伸展。3.自来水冲洗要掌握时间，避免标本褪色。4、低渗与离心等步骤的操作要轻。5.染色的时间可稍微长一些，防止染色不充分