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1、精选优质文档-倾情为你奉上 摘要:胚胎干细胞包括来自囊胚内细胞群的ES细胞和来自胚胎原始生殖嵴的EG细胞,其中ES细胞维持不分化传代培养已达80代。由于这些细胞具有高度复制能力及多向性分化潜能,近年来的研究使人们对胚胎干细胞的培养条件、表面分子标记和鉴定方法、诱导分化及其应用前景,以及当前研究方面存在的主要问题有了进一步的认识。关键词:ES细胞;EG细胞;培养;应用引言 干细胞是一种具有无限自我复制能力和向多种细胞分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞,前者指早期胚胎的多能干细胞(pluripotent cell),后者指在己特异分化的组织中具有干细胞特点的细胞如造血干细胞、成骨干细胞、
2、神经干细胞等。在过去的20年中,由于培养技术、分离技术的提高以及对干细胞特征如细胞表面抗原、遗传标记认识的加深,鼠和人的干细胞己建系上百株。无论胚胎干细胞还是成体干细胞均己展示出很好的临床应用前景,同时也将为基因功能研究、药物研究提供良好的工具。所以干细胞研究已成为生命科学的研究热点。本文作者主要就胚胎干细胞的研究进展作一综述。1ES细胞 从受精开始,两个高度分化的生殖细胞精子、卵子结合成双原核的受精卵,双原核受精卵不是干细胞,但它是真正的全能细胞(totipotent cell),能分化成机体及相关组织如胎盘的所有细胞。在小鼠受精后3.5天、人受精后5天,胚胎发育至囊胚阶段,经历第一次分化,
3、胚胎分化出内细胞团细胞(inner cell mass,ICM)和滋养层细胞(trophetoderm cell,TE)。其中ICM能培养成ES细胞(embryo stem cell,ES),它能自身复制,也能够分化包括生殖细胞在内的多种细胞,是多能干细胞。20世纪80年代初期,两组科学家几乎同时分别直接从鼠囊胚中分离出ES细胞1,2。这些细胞在白血病抑制因子(leukemia inhibiting factor,LIF)存在的条件下可维持不分化而自我复制。此后,科学家们一直致力于家畜及人类的ES细胞系的建立。直至1998年,Thomson等3首次报道在体外受精5天的人囊胚中成功分离出hES细
4、胞,体外培养维持不分化状态均传代30代以上,开创了胚胎干细胞研究的新纪元。 2EG细胞 胚胎干细胞的另一重要来源是胚胎原始生殖嵴细胞,又称胚胎生殖细胞(embrionicprimordial germ cell,EG细胞)。内细胞团形成后,首先分化成原始内胚层(primitive endoderm),接着分化形成外胚层(epiblast)的生殖层(germlayer),它是未来男、女性生殖细胞的前体。随着胚胎发育,这些细胞迁移至生殖嵴。当原肠胚形成(gastrulation),ICM分化多能性消失,而EG细胞分化多能性能则维持较长时间。 1992年,两组科学家直接从受精后812天的鼠胚中成功分
5、离出mEG细胞4,5,事实上,这些细胞有的来自迁移至生殖嵴前的生殖层细胞,有的是在上述细胞迁移至生殖嵴后获得1998,Shamblott6率先报道了从受精后59周的人胚胎中成功分离出hEG细胞并建系。在体外分化潜能方面,EG细胞具有ES细胞的很多特点,与hES细胞成功分离建系一样,hEG细胞系的成功建立成为1998年生命科学研究的重大事件。 3胚胎干细胞的分离培养条件 小鼠胚胎干细胞体外分离、培养条件的探索为人胚胎干细胞的研究提供了丰富的经验。目前hES、hEG细胞分离、培养基本采用了类似小鼠的方法,即采用免疫外科分离方法,从囊胚分离ICM,在无Ca2+、Mg2+的培养液中将分离出的ICM置于
6、饲养细胞上(feeder cell),饲养细胞多为经过照射,不能进行有丝分裂的鼠成纤维细胞3。最近亦有人成纤维细胞作为饲养细胞的报道7。EG细胞的获得多采用机械研磨加酶消化的方法,将特定时期的胚胎细胞转至有饲养层细胞的培养条件中6。人和鼠胚胎干细胞体外培养维持不分化所需的细胞因子不同,mES、mEG细胞需要LIF存在,LIF与LIF受体与膜蛋白gp130受体形成的异质性受体二聚体结合,激活受体相关的JAK蛋白激酶,使受体及相关蛋白磷酸化,从而促进转录因子STAT3二聚体形成并转移至核内,通过它与DNA靶部位结合,控制分化基因的转录,促进自我复制8。维持hES、hEG细胞不分化的因素不是LIF而
7、是鼠胚胎成纤维细胞9。但具体通过何种机制作用,目前尚不清楚。此外,hES、hEG细胞培养液中还需要成纤维细胞生长因子(fi-broblast growth factor)维持其生长,而mES、mEG细胞不需要3。目前报道的培养条件可允许hES细胞维持不分化至80代10,hEG细胞30代。 4胚胎干细胞的分子标记及其鉴定 胚胎细胞在发育的不同阶段,其细胞表面出现不同的抗原,又称分子标记。胚胎干细胞的分子标记是指在胚胎干细胞未分化状态下高度表达,一旦分化,基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达,可成为鉴定胚胎干细胞的依据。hES与mES细胞的分子标记研
8、究较为清楚,两者间分子标记有明显差异11,见表1。 表1不同时期胚胎hES与mES细胞表面分子标记比较Table1Compare of molecular mark satdifferent phases of hES and mES cell development 分子标记胚胎期28细胞期桑椹胚ICM滋养细胞 hES细胞SSEA1-+-+SSEA3-2+SSEA4-2+TRA-1-60-3+TRA-1-81-2+mES细胞SSEA1+2+SSEA3+-SSEA4+2+-TRA-1-60*-TRA-1-81”A-l-81-*细胞表面没有,但透明带内面存在至今已发现在人胚胎未分化多能干细胞表面
9、有13种分子标记。目前对这些分子标记的研究深度、了解程度基本可归纳为以下两种情况:分子标记物基因序列清楚,并已克隆,如基因库中NM-Sox2等;只是应用抗体检测能测得细胞表面抗原,其特征还需进一步了解12 ,如SEA-3,SEA-4,RA-1-60,RA-1-81,RA-2-54,CTM-2等。 5胚胎干细胞的诱导分化 在体外培养条件中如果不加LIF,mES分化在缺乏成纤维细胞饲养层或培养皿中细胞增多堆积时,hES、hEG细胞呈自然分化。目前已有报道,在培养皿中撤去成纤维细胞饲养层,hES、hEG细胞经过35天的培养,便分化形成胚体(embryo bodies),胚体中有来自外胚层的神经细胞、
10、上皮细胞,来自中胚层的造血细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞和来自内胚层的胰岛细胞3。体内研究表明,将mES细胞注入小鼠腹腔内,可形成含有三胚层组织的畸胎瘤,这种畸胎瘤细胞核型仍为二倍体,无恶性病变。将hES、hEG细胞注入免疫缺陷鼠皮下,可观察到含有人三胚层组织的畸胎瘤生长13 。由于对ES、EG细胞分化形成器官潜能的分子机制了解不多,虽然有神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞的诱导分化成功,但定向诱导分化仍然是当前需要解决的问题。这需要密切跟踪细胞分化的每一步骤,了解细胞终末分化之前经历的中间过程,通过对正常发育过程的了解,帮助建立多种细胞体外诱导分化的条件。 6胚胎干细胞
11、的应用前景及主要问题 由于胚胎干细胞的高度复制能力及多向性分化的潜能,已展示出很好的研究、应用前景。如将特殊改变的基因转导至ES细胞中,体外选择后将ES细胞导入机体,使ES中的遗传信息传达给子代,可能有助于克服出生缺陷,纠正某些遗传性疾病14 ;将经过基因修饰过的ES或EG细胞与正常细胞放在一起形成嵌合体,研究发育进程中细胞与细胞之间相互作用对细胞突变的影响15;将ES或EG细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入,研究特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿瘤形成的影响等1618 。最近有人用RNAi的方法使hES细胞中某个基因表达下降,获得较稳定的结果19。科学家们认为有希望通过该方法创建免疫无反
12、应的hES细胞系,从而控制hES细胞移植后的排斥反应,使hES细胞移植易于成功。人胚胎干细胞研究有望为目前临床某些难治性疾病提供治疗的新方法甚至治愈的可能性。如可将hES体外诱导分化的心肌细胞导入心室壁,替代己梗死的心肌功能20;应用体外分化的胰岛细胞治疗1型糖尿病19;应用诱导分化的神经细胞前体细胞治疗帕金森病22。有人预言,将来可应用胚胎干细胞在体外形成的器官取代功能衰竭的体内器官,为器官移植提供重要的来源保障。当然要实现胚胎干细胞的临床应用,还要做很多工作: 需要研究阐明胚胎干细胞基因组印迹状态(genomicim printing)。基因组印迹是某些等位基因的表遗传修饰,与胎儿发育异常
13、及肿瘤生长有关。在个体发育不同时期,基因组印迹状态不同。己有研究表明,鼠胚胎干细胞基因组印迹异常或不稳定23;但另一组研究者则发现人和小鼠EG细胞的基因组印迹基本正常,这可能为胚胎干细胞临床应用排除了一大障碍24。但对hES细胞的研究尚未见报道。 需要解决免疫排斥问题。研究表明,与其他同种异体的组织器官移植相比,虽然hES、hEG细胞移植的排斥反应较轻,但它仍不可避免地会发生。供者与受者ABO血型抗原、HLA组织相容性抗原、微组织相容性复合物抗原(minor histocompatility complex antigens MHC)的不同而诱发排斥反应25。解决这一问题的可能途径有:a.通过
14、减少同种异体间抗原的差异来减轻排斥反应。目前己有很多科学家呼吁建立干细胞库,移植前对供者-受者进行基因型配型,用基因型相近的供者干细胞移植。b.基因组替换(genomic replacement)。将受者的体细胞核注入去核的成熟卵细胞胞质中,在体外培养、受精,让其发育成胚胎干细胞,诱导分化,然后移植26,27 。c.长期免疫抑制药物治疗。d.进行hES、hEG细胞的基因操作,使与排斥有关的抗原如MHC细胞表面抗原和相关细胞如细胞表面抗原和相关细胞如CD95细胞减少28,29 。 胚胎干细胞的定向分化及分化细胞的分离纯化。胚胎干细胞的有效定向分化是今后干细胞研究的主攻方向之一。这需要基因组学、基
15、因功能学、分子生物学和细胞生物学等专家的共同努力。此外,为保证细胞移植受者的安全,用于临床的己分化细胞的分离和纯化也是重要的研究课题。 安全性的考虑。无论hES还是hEG细胞培养过程中需不同物种的细胞及细胞因子参与如鼠胚胎成纤维细胞,若某种病毒虽正常寄生在鼠体内,但却能引起人发病,这将对受者构成极大威胁。因此,胚胎干细胞的研究进展培养液中的饲养层细胞最好用人成纤维细胞,最近己有采用特殊基质(Matrigel)替代饲养细胞的报道9。参考文献:1EvansMJ,KaufmanMH.Establishmentincultureofpluripotentialcellsfrommouseembryos
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28、 transferfrommatureBandTdonorcellsJ.Nature,2002,415(6875):1035-1038.29LanzaRP.GenerationofhistocompatibletissuesusingnucleartransplantationJ.NatureBiotechnol,2002,20(7):689-696. (引言):本文概括介绍了人类胚胎干细胞系的建立、其广阔而独特的应用前景及发展中可能出现的问题和障碍。在最近一期的SCIENCE（1998年11月6日出版）和PNAS（1998年11月10日出版）杂志上，分别报道了两个实验室以不同手段几乎同时成功
29、地建立起人胚胎干细胞系，学者们给予了极高的评价，反映人们在这一领域长时间的期望和对将来的热切憧憬。本文介绍这一领域的历史、现状和展望。存在于哺乳动物发育早期胚胎（着床前）中的多能干细胞，具有持续增殖而不分化的能力，以及经诱导后可分化形成一个成熟个体中所有类型的细胞潜能1。这种被称作胚胎干细胞(embryonic stem, ES)的特殊细胞在基础研究及临床应用中都具有十分重要的价值。然而，ES细胞往往难以在体外保持其不分化的增殖状态，严重影响了人们对这种细胞的研究和应用。直到最近，人们还普遍认为，脊椎动物中只有小鼠ES才能在体外建成无限繁殖又不分化的细胞系2。许多工作都致力于揭示影响建系能力的
30、各种因素，如供体基因型及细胞体外培养周期等2。目前以为，小鼠ES细胞系的建立3,4从根本上依赖于小鼠细胞所特有的某种信号传递系统，如抑制因子（leukemia inhibitive factor, LIF）及相关细胞因子系统或某种相应的应急系统5。人们尚不清楚其它细胞，包括人体细胞中是否也具有与此相类似的系统。小鼠ES细胞系的建立，结合基因打靶技术的应用，向人们展示了ES细胞系所能提供给人们的极广阔的应用前景。人们能够获得大量特定基因型的细胞用于罹病细胞的替换或系统的重建；也使得人们可以培育出特定基因的纯合小鼠，可以在整体水平研究小鼠胚胎发育、基因功能与调控等多种现象。这种优势一直激励着人们知
31、难而上，致力于人ES细胞系的建立。Thomson领导的小组，多年从事哺乳类动物胚胎干细胞的研究，期间所积累起的经验，使他们敢于尝试人ES细胞系的建立6。他们将合法获得的体外受精的人早期胚胎在体外培养至囊胚期，参照恒河猴ES细胞分离法7，以抗BeWO细胞的单抗作免疫标记，剔除外层细胞，以35 gray 射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞作滋养层，体外培养人囊胚内细胞群（inner cell mass），915 d后，将长出的细胞团吹散或者用胰酶或EDTA消化，然后继续在小鼠滋养层细胞上生长；挑选具有均一的未分化形态的单克隆细胞团，吹散成50100个细胞的小团后再行培养；如此重复，直至成系。期间每一步都
32、需观察细胞染色体核型，以确定其未曾癌变。此后细胞系经吹打或胶原酶IV处理长期传代。作者从14个囊胚中，最终建立起5个人类ES细胞系，包括3个XY核型细胞系及两个XX核型细胞系。这些成系细胞从形态上观察，具有较高的核质比例、明显的核仁及与恒河猴ES细胞相似的克隆形态；它们表达高水平的端粒酶活性，端粒酶负责维持染色体末端的完整性8，为包括人胚胎干细胞在内的永生细胞所特有，分化细胞内无此酶活性9；细胞表面表达灵掌类胚胎干细胞所特有的未分化抗原，包括SSEA-3，-4、TRA-1-60，-81及碱性磷酸酯酶。作者还将所建细胞注射到严重联合免疫缺陷的小鼠（SCID mice）中，获得畸胎瘤，组织学实验分
33、析其中包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞，直接证明所建细胞具有多向分化的全能性。作者已经成功地将细胞体外传至32代，并经反复的冻融，细胞核型依然保持正常和稳定。Gearhart领导的小组，几乎在同时发表了他们建立人胚胎干细胞系的报道10。他们采取了与Thomson小组不同的方法，从59周龄流产胎儿的性腺嵴(gonadal ridges)及肠系膜中分离原始的干细胞(primordial germ cells，PGCs)，这也是一种多能的胚胎干细胞，为区别ES细胞，命名为embryonic germ (EG) 细胞。这样有可能避免因直接利用胚胎而造成的伦理学上的麻烦。作者将EG细胞体外培养于小鼠
34、成纤维细胞层上，培养体系中加入重组人白血病抑制因子，重组人碱性成纤维细胞生长因子及forskolin， 721 d后形成较大的多细胞集落，其形态与小鼠EG或ES细胞集落相似。作者经过一系列与Thomson实验室相似的免疫组化及功能实验，证明获得了可成系的两种核型的人胚胎干细胞集落。人ES细胞系的建立将促进对人胚胎发育细节的基础研究。在此之前，有关人胚胎发育的研究都是基于动物模型，主要是小鼠模型之上，然而，人与动物胚胎之间却存在很大的差别，例如，人与小鼠在胎盘、胚胎外膜结构及胚胎层面上都有本质上的区别。如今，人们可以培育出大量人胚胎发育过程中不同时期的细胞，通过对它们基因表达的研究观察，有望认识
35、畸胎儿发生的机制。另一个有望在短期内就能体现的优势在于医用药物的筛选中，目前用于药物筛选的细胞都来源于动物或癌细胞这样非正常的人体细胞，而ES细胞系可以经体外定向诱导，为人们提供大量各种组织类型的人体细胞。定向分化的尝试在小鼠中已取得可喜结果，神经元、造血细胞及心肌细胞已在体外经诱导获得1113，而体外随意诱导人类体细胞的愿望可望不久成为现实。ES细胞系最大的优势可能在于能为器官移植提供无免疫异原性的材料14。许多人类的疾病，如帕金森氏病及某些类型的都是个别类型细胞的死亡或功能异常引起的，只要向病人移植正常功能的同类细胞，即可获得治疗。人们可以以多种手段改造ES细胞系，经定向诱导分化，即可获得
36、无免疫排斥的单纯特定细胞用以移植15，手段包括：1) 建立包含多种MHC基因型的胚胎干细胞库以供随意选用；2) 建立经遗传改构的通用型MHC基因型胚胎干细胞系，这种细胞已在小鼠中获得初步的成功；3) 借助基因打靶技术，度身定做一个与受者MHC同型的ES细胞系；4) 借助核移植技术，将受者细胞的全部基因组转移给ES细胞，建立特定受体相同基因组型的干细胞系。当然，目前欢呼新时代的到来尚为时过早，依然存在许多有待提高甚至验证的因素。作者所报道的实验方法和步骤从表面上看来并无特殊之处，许多其它实验室一直在以同样的方法试图获得人ES细胞系，人们希望进一步看到这一实验结果的可靠性和重复性；另外，从14个囊
37、胚出发才建立起5个细胞系，是否还能提高建系效率；以前人们一直认为，小鼠细胞中LIF相关信号系统的存在是支持从小鼠囊胚建立小鼠ES细胞系的关键，那么，是什么系统对于建立人ES细胞系至关重要呢？甚至还有人怀疑，借助小鼠建系的经验和方法，是否真能建立起人的ES细胞系呢。进一步讲，即使解决了上述疑惑，人们依然还有很多工作要完成，首先人们还不能有效地诱导干细胞向特定的细胞类型分化，另外，更困难的是，还不能有效地建立起无免疫原性的ES细胞系。而撇开技术因素，人ES细胞系的建立和应用还涉及到伦理道德方面观念的制约。在90年代初，当人们第一次谈论起建立人ES细胞系前景时，美国政府已经制定出法律限制国家基金资助
38、相应的工作，而在今年10月通过的美国国家拨款条例中又就此内容进行了更严格的限定。SCIENCE杂志在刊登相应文章的同时，还特意发表了编者按，解释发表此类文章背后的抉择，显得极其谨慎。种种限制制约了多数研究者继续从事这一领域的工作，而愿意提供开展这方面工作的私人和集团基金也因担心没有回报而忧心忡忡，必然会影响这一领域的顺利发展。但很显然，这一领域发展中的瓶颈问题已经得到初步的解决，人们有理由为此感到欢欣鼓舞。（本文承蒙吴克复教授、尤胜国教授审阅，谨致谢忱。）参考文献1Thomson J A, Marshall V S. Primate embryonic stem cellsJ. Curr To
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