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1、精选优质文档-倾情为你奉上干细胞之家 操作指南运输和保存：人胚胎干细胞（ hESCs）和PMEFi被装在含90FCS和10二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4106/管，可接种一块六孔板。冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入80保存。培养条件：温度：370.5 CO2浓度：5.10.6 相对湿度：85-100%主要技术：1 细胞培养：当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的
2、空间。当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。工作间在使用前后要用70的异丙醇彻底消毒。2 培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2m的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70异丙醇消毒。3 细胞处理为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。所有的细胞离心：室温，500600g，5分钟。干细胞之家 培养液准备：MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2m的滤膜过滤。当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。如有可能，尽量使用相同的试剂。使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。生长因子应该
3、最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。MEF培养液： hESCs培养液： 冷冻培养液：90FCS+10%二甲基亚砜, 0.2m的滤膜过滤,4保存。明胶准备：用超纯水配制0.1明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2m的滤膜过滤。明胶包被：干细胞之家 接种细胞前，用0.1明胶溶液包被培养皿，37至少30分钟，分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。在接种MEF前吸除明胶溶液。准备MEF：可靠的MEF对hESCs的生长和存活是非常重要的。每管含 4106PMEFi，可接种一块六孔板。在复苏/传代hESCs前一到二天接种PMEFi，M
4、EFs超过1214天不能再用作滋养层。种植MEFs：37预温MEF培养液，吸10ml到15ml无菌离心管中。从-80取出MEF冷冻管，立即沁入37水浴中，大约3045秒，细胞有80融化时取出，立即拿进超净台，70异丙醇消毒。把细胞加有培养液的离心管中，最好用1ml培养液冲洗冻存管，也加到离心管中。500600g，离心5分钟。离心同时，从培养皿中吸出明胶，离心后，小心弃去上清，用12ml（6个孔）培养液重悬细胞，充分混匀，每孔加入2ml。标记MEF皿，37过夜，让MEF贴壁。6小时后细胞贴壁，最好在接种2448小时使用，不要使用超过4天的MEF.hES dells所得到的hES cells在10
5、cm培养长满后，分装6瓶，密度4105cells/ml对于绝大多数冷冻管。HUES-9为0.5ml，复苏时时间要比其系短一些。建议每管复苏到一个35mm培养皿中，或6孔皿的一个孔。复苏1. 接种hES细胞：复苏前应确保MEF已经被准备好且状态良好，不要应用MEF状态不好或超过3天的皿，建议事先标记好所有的离心管和培养皿。干细胞之家 预温hES培养液到37，一个细胞系吸取10mlhES培养液到无菌的和标好的15ml离心管中，从液氮中取出hES冷冻管，立即将冷冻管的下半部浸入37水浴中，大约4560秒，细胞80%融化时从水浴中取出，立即将冷冻管拿到超净台中，70%酒精消毒，轻轻移入10ml预温培养
6、基中。建议用1ml预温培养液洗冷冻管后一并移入15ml离心管500600g，5min，离心时，从培养箱中取出MEFS，在超净台里吸出培养液（需要几个孔吸几个孔），立即加入1ml hES培养液，小心不要碰到MEFS，将其放置在超净台内，离心完后，小心吸出培养液，不要碰触离下来的细胞团（如有必要不要吸出所有的培养液。用1ml培养液轻轻重悬细胞团，将1ml hES 溶液轻轻滴加到预先加入1ml hES培养液的MEF上，和MEF一样尽管使其均匀分布在培养皿上，轻轻移入培养箱，37过夜，让hES接种到MEFS上。hES细胞培养hES细胞培养是费力的，除了复苏/传代的之外，培养液应该每天被更换。此外，复苏
7、或传代之后经常出现生长滞后现象。因此，每天观察细胞非常重要，必须保证提前两天准备MEF，因为传代的时间可能会超出你的预期。请注意，我们已经观察到在这些HUES细胞系，染色体的改变包括12三体（在两个细胞系：hVES-3和4）和其它改变（HUES-1 2号染色体增加）。这些染色体的异常与增殖特点和双链期短等有关。由于染色体异常在hES细胞系中是普遍的，建议经常进行染色体分析。Day1hES细胞复苏24h后，4倍光镜观察，能看到有一些碎屑，这是正常的，干细胞之家 不用担心，这些碎屑是死细胞的混合物。在这个早期阶段，不要指望看到一些细胞团，如果死细胞层完全覆盖孔皿，建议更换部分培养液。Day2-4通
8、常复苏48h后第一次全部换液，建议2ml/well，复苏后第二天细胞团可以看到，以后每天更换培养液。Day4-7根据我们的经验，复苏后最早4天最晚10天（此时MEF太老了）需要传代。传代前的天数通常依赖很多因素，包括被复苏细胞的状态，平均起来，培养接近长满大约需要7天时间，对于一个给定的细胞系如何操作，请和我们联系。如果复苏的细胞不能重现附录中描述的景象也不要气馁，我们已经注意到在复苏时有些不一致，一些细胞系比另外一些更稳定，出现不协调、扁平的细胞团，也是不少见的，甚至在极个别情况下全出现单层细胞，此时不要放弃，HVES细胞系的细胞形态在传一到两代后得到改善是很常见的。hES细胞传代复苏47天
9、后，细胞接近融合，接近融合的细胞通常13传代。在细胞分化前进行传代是非常重要的，如果细胞团在接近融合前开始变得带褐色，需要提早12传代。同样，如果细胞密度太大传代时也需要调整（平均分配，彼此接触）。13传代传代之前，确保你有预先铺好MEF的3孔皿。MEF贴壁24h，但不超过3干细胞之家 天。37预温hES培养液和0.05%胰酶，在超净台里，预先标记一个15ml离心管，从培养箱中取出MEF，在超净台里吸出三孔的培养液，然后立即回加1ml/孔hES培养液，小心不要碰触MEF，然后将其防在超净台里。下面的步骤要迅速以减少细胞没有hES培养液的时间。从培养皿吸去hES培养液，用1PBS轻轻洗孔皿，吸去
10、PBS，加入0.3ml0.05%胰酶到孔皿中，盖上盖，在4倍光镜下观察细胞，hES细胞团周围的MEF开始回缩。当MEF充分变圆及hES细胞团界限变得粗糙时，放回超净台，加2ml预温hES培养液到消化的细胞上，轻轻吹吸，洗皿底，直到MEF单细胞层完全分离（单细胞层很粘，可能仍有少量贴壁）。把细胞悬液移入预先加入10ml培养液的离心管中，用1ml培养液洗孔皿，同样加到离心管中，此时，胰酶完全被抑制。用加样器吹吸细胞悬液57次，分别将1ml悬液均匀滴加到孔皿中，不要晃动瓶皿，将孔皿轻轻放入37培养箱过夜，让hES接种。传代hES细胞与其上代复苏细胞特征相似。MEF原代培养鼠准备：性交后12.5天的孕
11、鼠。鼠胚收集：收集前，用明胶包被15cm组织培养皿，1.52胚胎/皿，每只鼠大约12胚胎（需68个培养皿）。此外，准备盛有PBS1的10cm培养皿3个/鼠。干细胞之家 37预温MEF培养液和0.05%胰酶。处死孕鼠，从子宫中取出胚胎置于1PBS。在超净台显微镜下从胎膜中取出胚胎，解剖去其内脏（肠、肝、心脏等）。把干净的胚胎移到一个干燥、无菌的10cm培养皿中。用无菌手术剪刀切碎胚胎，加0.05%胰酶10ml/1014胚胎，反复吹吸直到胚胎小块均匀散开，将溶液移至50ml离心管中，37孵育1min，吹吸溶解510次。接种原代MEFS加入40ml预温的MEF培养液至溶液中，500600g. RT.
12、10.弃掉上清，加入30ml预温MEF培养液重悬沉淀，接种1.52个胚胎（5ml溶液）/15cm明胶包被培养皿，终体积为20ml，37孵育。培养皿长满后，13或14传代到新的25cm组织培养皿上（不用明胶包被），37孵育，到细胞再次长满。原代MEF冻存预温MEF培养液和0.05%胰酶，将冷冻培养液置于冰上，向50ml离心管中加20ml预温培养液（MEF）（3个皿一管），同时取出3个培养皿，弃掉培养液，1PBS 5ml洗一次，加5ml胰酶/皿，让细胞回缩，将胰酶溶液吸到50ml离心管中，用另外5ml胰酶洗三个皿一次，同样加到离心管中，最后用10ml预温MEF培养液再洗一次，加到离心管中，1000
13、g离心5分钟，弃上清，加9ml冷冻培养液重悬（13冷冻）。每个管中加入1ml（约3106细胞），1/干细胞之家 分冷冻（？包好-80过夜），液氮贮存。MEF传代一瓶原代MEF47天将长满15cm培养皿，大约有10106个细胞（6孔皿约3106/6孔）。预温MEF培养液，向50ml离心管中加入10ml/冷冻管，从液氮中取出冷冻管立即将其下半部浸入37水浴中，停留4560秒，此时细胞约80%融化（少部分未融），迅速拿到超净台中，70%酒精消毒，将细胞轻轻移入预温培养液中，500600g离心，加5ml/管重悬细胞，将15ml预温MEF培养液加入15cm培养皿中，将5ml MEF溶液加到15cm培养皿
14、中，均匀分配，标记（日期，第2代P2），37，孵育。MEF处理MEF一旦长满，必须用丝裂霉素C或射线抑制其分裂。丝裂霉素C抑制有丝分裂用MMC处理培养皿，吸出培养液15ml/皿，加到50ml离心管中，加入适量MMC使终浓度为10g/ml，混合溶液，弃掉每个皿中剩余的5ml培养液，将离心管中含MMC的培养液回加到培养皿中，15ml/皿，37孵育3h。预温MEF培养液和0.05%胰酶到37，向50ml离心管中加入20ml预温培养液（3皿/管）。从孵箱中同时取出3个皿，弃去培养液，用1PBS 5ml洗1次，加胰酶5ml/皿，让细胞漂起，吸到离心管中，用5ml胰酶洗三个皿，同样加到离心管中，最后用10ml新的预温的MEF培养液洗一次，加到离心管中，用计数板计干细胞之家 数细胞密度，500600g离心（继续传代和冷冻）。接种新处理的MEF如果需要用处理过的MEF，用预温的MEF培养液重悬细胞，如果接种6孔板调整细胞密度到4106 cells/12ml（如是10cm培养皿则为4106 cells/10ml）。冷冻处理的MEF如果不需要处理的MEFS，将其以4106 dells/管（方法如前），-1/min。-80贮存。干细胞之家 专心-专注-专业