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1、河南科技大学河南科技大学教案首页教案首页课程名称授课章节教学目的和要求：掌握生物技术在园艺植物育种中的应用。教学基本内容：第一节组织与器官培养第二节花药与花粉培养第三节原生质体培养第四节体细胞杂交第五节植物细胞突变体的离体筛选第六节基因工程与育种第七节分子标记与育种教学重点和难点：基因工程与育种；分子标记与育种授课方式、方法和手段：1.多媒体结合板书。2.布置学生自学查找资料。3.展示图片资料。作业与思考题：1.基本概念：生物技术、组织培养、外植体、体细胞杂交、体细胞无性系变异、基因工程、分子标记2.简述各项生物技术方法在园艺植物育种中的主要应用。园艺植物育种学计划学时4第十一章生物技术在园艺
2、植物育种中的应用第十一章第十一章生物技术在园艺植物育种中的应用生物技术在园艺植物育种中的应用生物技术(Biotechnology)是以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。生物技术是在分子生物学和细胞生物学基础上结合现代工程学的方法和原理而发展起来的一门综合性科学技术。植物组织培养（Plant Tissue Culture；In Vitro Culture）：将植物离体器官、组织或细胞等外植体，在适宜的人工培养基和无菌条件下，给予光照、温度等环境条件并培养，使其生长、增殖、发育形
3、成小植株的方法。狭义的组织培养往往仅指愈伤组织培养，广义的组织培养指各种类型的植物无菌培养技术。组织培养概念多指广义上的组织培养技术，包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养等。第一节组织与器官培养组织与器官培养的类别组织与器官培养(tissue and organ culture)：茎尖和分生组织培养；胚培养；胚珠和子房培养；胚乳培养；离体叶的培养。相关专业术语相关专业术语细胞全能性(Totipotency)：一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。外植体(explant)：用于培养的离体材料。愈伤组织(callus)：在培养过程中,从植物各种器官、组织的
4、外植体增值而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。胚状体(embryoid)：由外植体或愈伤组织产生的,与正常受精发育方式类似的胚胎结构。继代培养(subculture)：对外植体增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代培养。组织和器官培养全过程可分四个阶段：无菌培养物的建立、营养繁殖体的增殖、生根、植株移栽。各个阶段在培养基，生长调节剂的配比和浓度，培养方式和环境上都不同的要求。组织和器官培养在育种中的作用组织和器官培养在育种中的作用加快园艺植物新品种和良种繁殖速度；培养无病毒苗木；诱发和离体筛选突变体；进行种质资源长期保存和远距离运输；获得倍性不
5、同的植株；克服种子发育和萌发中的障碍；克服远源杂交困难；提供育种中间材料。第二节花药与花粉培养花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。花药培养的基本程序：外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养。在离体培养条件下要使花药中的花粉改变其正常发育方向而形成单倍体植株，需要各种因素共同调节和控制。外因方面：培养基的成分，外源激素的种类，糖的浓度内
6、因方面：主要决定于花药中花粉发育时期培养基：花药培养常用的基本培养基：MS（Murashigc&Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。附加成分：蔗糖，激素。花药培养常用的激素细胞分裂素类：BA 6-benzyladenin；KT kinetin；Zeatin。生长素类：NAAnaphthalene acetic acid；IAAindole-3-acetic acid；2,4-D2,4-dichlorophenoxyacetic acid。蔗糖：蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供 C 源；
7、维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。表：番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应花粉发育时期四分体 小孢子 单核花粉双核花粉最适期花粉及小孢子培养1取材时期的确定四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。单倍体(haploid)：指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。diploid 植物，其 haploid 即为 monoploid玉米2n=2x=20n=x=10柑橘2n=2x=18n=x=9tetraploid 植物，其 haploid 为 dihaploid马铃薯2n=4x=48n=2x=24hexaploid 植物，其 hap
8、loid 为 triploid普通小麦 2n=6x=42n=3x=21octoploid 植物，其 haploid 为 tetraploid草 莓2n=8x=56n=4x=28单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在加倍后可迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。获得育种中间材料。与诱变育种相结合可以提高诱变频率。与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义，无籽三倍体。作为遗传工程受体更为有效。用于基础遗传研究的各个领域。获得超雄植株（YY)。可获得异源体附加系、代换系和易位系。第三节 原生质体培养原生质体培养和体细胞杂交的步骤原生质体培养：Protoplast culture体细胞杂交：S
9、omatic hybridization原生质体融合：Protoplast fusion一、原生质体的概念原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。胞质体(cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。二、原生质体的分离1.分离原生质体材料
10、的准备无菌试管苗叶片、上胚轴和子叶、培养细胞2.预处理及酶解酶、酶解、渗透压调节剂材料预处理在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。例如龙胆试管苗的叶片只有用 4低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养12h 后分离的原生质体才能分裂。表：原生质体分离常用的商品酶酶溶剂及其渗透压溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶处理：3.原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll
11、。沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用 Percoll 飘浮一次。4.原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA 法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA 被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。FDA 荧光染色法(双醋酸荧光素)：在荧光显微镜下，有活力的原生质发荧光，无活力的不发荧光。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。影响原生质体活力的因素
12、分离材料的生理状态酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响三、原生质体培养1.原生质体培养基无机盐：大量元素浓度；NO3-和 NH4+的比例；Ca2+浓度有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。2.原生质体培养方法液体浅层培养、固体平板培养、固液体双层培养、琼脂糖珠培养第四节 体细胞杂交定义：将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）几种不同的表述：体细胞杂交：Somatic hybridization细胞融合：Cel
13、l fusion原生质体融合：Protoplast fusion无性杂交：asexual hybridization超性杂交：Parasexual hybridization超性融合：Parasexual fusion细胞工程（Cell engineering）植物细胞杂交的几个重要进展：1960 年，Kocking 用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971 年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972 年，Carlson 首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物细胞杂种；1974 年，Kao 将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融
14、合技术；1978 年，Melchers 获得第 1 个属间细胞杂种（番茄马铃薯）；1981 年，Zimmerman 发明了电融合仪，并首次提出电融合概念；1987 年，Schweiger 建立了单对原生质体电融合技术程序。体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容时间亲缘关系体细胞杂交无季节限制一定程度上可以克服有性/嫁接不亲和性有性杂交花期限制，特别是母本的花期受亲和性影响结果细胞核、细胞质均可以重组、双受精，一般无细胞质重组，倍性增加倍性不改变原生质体融合的有关名词对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为 100%）非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）胞质杂种（cytoplasmic
15、hybrid,Cybrid）：细胞质重组，细胞核未重组对称融合（symmetric fusion）也称标准融合（Standard fusion）非对称融合(asymmetric fusion)：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分供-受体融合：Donor-recipient fusion体配融合（gameto-somatic fusion）（性细胞与体细胞融合）亚原生质体-原生质体融合：Subprotoplast-protoplast fusion小原生质体：Miniprotoplast微原生质体：Microprotoplast胞质体：Cytoplast胞质体-原生质体融合:Cytopl
16、ast-protoplast fusion原生质体融合的方式化学方法：聚乙二醇法Polyethylene glycol（PEG），与高 pH 高 Ca 结合使用物理方法：电融合法Electrofusion,Electrically induced fusion理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体 DNA 亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。体细
17、胞杂交的程序及方法原生质体融合杂种细胞筛选方法：PEG，电融合，NaNO3营养互补选择法，遗传互补选择法，机械选择法，形态学方法细胞学方法同工酶方法分子标记法体细胞杂种植株的鉴定杂种融合体筛选杂种融合体移栽至不同的培养基体细胞杂交筛选原生质体培养和体细胞杂交的应用获得新品种；创造新种质；转移有利性状和克服远源杂交的障碍；作为基因工程的良好受体及进行突变体筛选的优良原始材料。第五节 植物细胞突变体的离体筛选一、突变体的产生在离体培养条件下，诱发突变的突变型和自发突变没有本质上的差别。一般都在三个水平上发生：基因组突变，如染色体数目的改变或细胞质基因组的增减；染色体突变，指染色体较大范围的结构变化
18、，涉及多个基因；基因突变，指范围在一个基因以内分子结构的改变。按 DNA 的改变方式有碱基置换突变、移码突变、缺失突变和插入突变。体细胞无性系变异：Somaclonal variation二、突变细胞的筛选方法直接选择法：正选择/负选择间接选择法正选择：其方法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有 1.4 NaCl 的 N6 培养基上直
19、接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系游离氨基酸含量是供体亲本的 4.1 倍。郑企成等也曾将小麦“京花 1 号”花药经射线处理后，再经 0.5 NaCl 培养基直接筛选获得耐盐再生株系。李爱贤等以甘薯“栗子香”为材料诱导胚性细胞系，从 900 个通过射线辐射的细胞团中，在含有 2.0NaCl 的培养基中进行筛选，获得 22 个抗盐愈伤组织，并获得 20 个抗盐再生植株。负选择：负选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。Dorffling 等以 Pro 类似物羟脯氨酸（HYP）为选择剂，获得了耐 HYP 的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传。林定波等将锦橙株
20、心细胞愈伤组织的悬浮细胞经射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，并再生植株。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高 1.4和 2.4，突变系体内的 Pro 含量比供体增加了一倍。三、突变性状遗传基础及其稳定性鉴定1.突变性状的遗传学基础体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的是基因水平上的变异。从利用体细胞变异的角度，染色体变异大多是一些畸形变异，真正可利用的染色体变异十分有限。基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的改变，不会影响再生植株的正常生长发育。因此，从再生植株的这些变异中有可能筛选有益的变异。基因水平上的变异，从根本上讲是
21、DNA 的碱基突变或修饰状态的改变。2.突变性状的稳定性对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。Brettell 等从 645 株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个稳定突变体Adh1（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的 GAG 中的 A 转换成为了 T，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。第六节 基因工程与育种植物基因工程（p
22、lant genetic engineering）：指以类似工程设计的方法，按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的 DNA 片断，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。转基因植物：transgenic plant转基因技术：Transgenic technique6.1 Definition基因工程：指把不同生物有机体的 DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组 DNA(recombinationDNA)分子，然后转化到受体细胞（如,大肠杆菌），使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的
23、方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译和表达。图：植物基因转移的过程基因工程的基本步骤和方法目的基因的分离与鉴定植物表达载体的构建植物的遗传转化转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定图：农杆菌和基因枪介导基因转化流程图6.2 应用一、提高抗病能力抗细菌基因工程途径：过量表达法；克隆转化溶菌酶基因或杀菌肽基因抗真菌基因工程途径：克隆并导入几丁质酶基因和-1,3葡聚糖酶基因；克隆并导入抗毒素。过量表达来自番茄 PR 蛋白的甜橙抗脚腐病过量表达 CTV CP 蛋白的来檬抗 CTV实例CTV symptoms of different intensity in young leaves after gr
24、aft-inoculation withCTV T-305.Severe leaf distortion and stunting symptoms in a non-transgenic controlplant(left),delay in virus infection and symptom attenuation in a transgenic plant(centre),and resistance against CTV T-305 in other transgenic plant(right).如.1986 年 Beachy 等将烟草花叶病毒的外壳蛋白基因（TMV-CP)导入
25、烟草中，发现转基因植株发病时间明显延迟或病毒的症状明显减轻抗病毒基因工程途径：向植物中导入病毒外壳蛋白（CP）；转移病毒的反义 RNA、卫星 RNA、病毒复制酶基因和核酶基因等。转病毒 CP 基因番木瓜实例：苹果转 attacin LP 基因的 Royal Gala4 年田间试验表明：抗性增强，果实品质正常。转 attacin 基因的苹果抗 fire blight转 avian lysozyme 基因的 Royal Gala转 Harpin 基因的苹果与对比抗感 fire blight 苹果的比较抗 fire blight 病的转基因苹果二、提高抗虫能力苏云金芽孢杆菌（Bt)制剂产生的原毒素伴
26、孢晶体毒蛋白（内毒素），可在昆虫幼虫中肠道的水解酶作用下，转化成小分子的毒素多肽，而对多种昆虫有很强的毒杀作用。1.导入 Bt 毒蛋白基因Hinder 等将编码豇豆胰蛋白酶抑制物（CpTI)的基因转移到烟草中，明显增强了转基因烟草对烟草夜蛾幼虫的抗性。如将蜘蛛杀虫肽基因导入烟草，转基因烟草表现出对棉铃虫有较强的抗性。3.利用一些昆虫毒素基因2.导入蛋白酶抑制剂三、改善抗逆性1.向植物中导入热休克基因,可大幅度提高其抗热性2.将深海鱼美洲拟鲽的抗冻基因通过柱头导入番茄，获得可耐受-4-5低温的转基因番茄。3.导入与脯氨酸或甜菜碱合成有关的酶的基因如甜菜碱醛脱氢酶（BADH)基因导入烟草、草莓和水
27、稻后，转基因植物的耐盐性明显提高。转基因烟草的光合特性1 处理 4hr,27 测定光合作用，低温导致的光合作用下降率为：转拟南芥菜的为 7，转南瓜的为 88，对照的为 25。转基因植株的脂肪酸的构成转入抗寒性强的拟南芥菜的基因，其不饱和脂肪酸的含量显著增加转入抗寒性弱的南瓜的基因，其饱和脂肪酸的含量显著增加转基因烟草的抗寒性转基因烟草在 1 下处理 10 天，25 栽培 2 天，前者无黄化，后者有黄化。A,野生型.B:对照 pBI121,C,南瓜，D，拟南芥菜四、选育抗除草剂品种1.把除草剂作用的靶酶或靶蛋白质的基因导入植物现已在矮牵牛、烟草、番茄、马铃薯、大豆、油菜、杨树等植物上获得抗除草剂
28、的转基因植株。2.转移一种能以除草剂为底物的酶的基因如 bar 基因编码 PPT 乙酰转移酶，导入烟草，番茄和马铃薯等植物后，使作物获得抗除草剂 PPT 的能力五、延迟成熟与保鲜途径：1.改变果实细胞壁降解酶活性；2.抑制成熟激素乙烯的生成美国 Calgene 公司以将反义 PGcDNA 导入到番茄中，育成“FLAVRSAVE”转基因品种，并已上市。叶志彪等利用 ACC 氧化酶反义基因转入番茄，抑制 ACC 合成酶的表达活性，抑制乙烯的合成，育成耐贮藏的转基因番茄。实例：苹果乙烯形成的沉默六、提高产量提高光合作用效率和固氮效率克隆与杂种优势相关的植物雄性不育有关的基因目前已克隆出许多种参与光合
29、作用的基因和导致植物雄性不育的基因。Worral等报道用编码-1、3 葡聚糖水解酶基因转化烟草、矮牵牛获得雄性不育植株。七、改良品质将人工合成的富含必须氨基酸的 DNA 片段导入马铃薯，能有效地改善马铃薯贮藏蛋白的氨基酸成分。通过导入淀粉粒结合的淀粉合成酶 的反义 RNA 基因，可改变马铃薯支链淀粉和直链淀粉的比例。陈章良将 Chs 的反义基因转入矮牵牛中，导致 Chs 的 mRNA 水平以及 Chs的酶活性都大大降低，可改变矮牵牛的颜色。异戊烯转移酶基因(ipt)导入番茄可使果实可溶性固形物含量显著增加。MdTFL（抑制芽分生组织 identity 基因）：苹果顶端分生组织从营养期向生殖期的
30、转变八、提前开花结实实例：早花苹果的花和果实转 Leafy 基因杨树早花4.3 转基因植株的筛选方法：形态学鉴定、直接选择法、间接选择法、同工酶测定、分子标记。第七节 分子标记与育种（Molecular marker&breeding）遗传标记（genetic markers）：鉴别基因组中基因位点(site)的手段，是易于识别且可遗传的实体。遗传标记的种类：形态标记（morphological markers）、细胞学标记（cytologicalmarkers）、生化标记（biochemical markers）、分子标记（molecular markers）种类：形态标记：指那些能够明确显
31、示遗传多态性的外观性状，如株高、果形、花色、叶形、花瓣数多少、核有无或抗逆性、抗病性等。特点：简单直观，长期以来，作物种质资源鉴定及育种材料的选择一般都是根据形态标记进行的，但是形态标记数目少，多态性差，易受环境因素的影响。应用实例：园艺植物品种识别；枳在柑桔原生质体融合中的应用细胞学标记：染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。染色体结构特征包括染色体的核型(染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等)和带型(Constitutiveheterochrom-ative banding 带、Necleolar organizer re
32、gion banding 带、Giemsabanding 带等)。特点：可明确鉴定许多物种中任一染色体。操作复杂，信息量小。应用实例：资源分类与品种鉴别；多倍体亲缘关系与系统进化；染色体组分析评价亲缘关系；原位杂交进行基因物理定位。生化标记同工酶同工酶：指有同一底物专一性，催化同一化学反应，结构、组成不同的一类酶。基本原理是根据电荷性质的差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和专门染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同的基因型。特点：受环境因素影响小，呈共显性，在分离世代中能反映各单株的基因型，检测相对简单快速，在种子和幼苗期就可以鉴定，费用不高。具有组织、发育和物种特异性。应用实例：品种质量和
33、纯度鉴定；遗传多样性研究分子标记：以直接检测 DNA 碱基序列的差异为基础的遗传标记，又叫 DNA 分子标记。特点：数量多，遍布整个基因组；标记本身无害，很少与不良性状连锁；标记不需要基因表达，可用个体的任何材料进行检测，不受环境条件的限制；多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。多以DNA 片段电泳谱带形式表现。应用：种质资源研究；辅助育种；功能基因组研究；基因克隆表：几种常用分子标记方法比较RAPD 标记鉴定分子标记在园艺植物育种的应用构建遗传图谱分析亲缘关系定位农艺性状分子标记辅助选择种质资源及杂种后代的鉴定