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1、脂溶性维生素的测定第1页，本讲稿共14页 脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的理化性质：脂溶性维生素的理化性质：溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、苯、乙溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等有机溶剂。醚等有机溶剂。耐酸碱性：耐酸碱性：VA、VD对酸不稳定，对碱稳定；对酸不稳定，对碱稳定；VE对酸稳定，对碱不稳定。对酸稳定，对碱不稳定。耐热性：耐热性：VA、VD、VE耐热性好，能经受煮沸耐热性好，能经受煮沸耐氧化性：耐氧化性：VA易被氧化，光、热促进氧化易被氧化，光、热促进氧化 VE易被氧化，光、热、碱促进氧化易被氧化，光、热、碱促进氧化 VD性质
2、稳定，不易氧化性质稳定，不易氧化第2页，本讲稿共14页维生素维生素A的测定的测定 维生素维生素A类是指含有类是指含有-白芷酮环的多烯基结构、并具有视黄白芷酮环的多烯基结构、并具有视黄醇生物活性的一大类物质。广义而言包括已经形成的维生素醇生物活性的一大类物质。广义而言包括已经形成的维生素A和维生素和维生素A原。原。动物体内具有视黄醇生物活性功能的维生素动物体内具有视黄醇生物活性功能的维生素A类包括视黄醇、类包括视黄醇、视黄醛、视黄酸等物质，视黄醛、视黄酸等物质，4-氧视黄酸、氧视黄酸、4-羟视黄酸等不具有视黄羟视黄酸等不具有视黄醇生物活性功能。醇生物活性功能。维生素维生素A分为维生素分为维生素A
3、1和维生素和维生素A2，A1主要存在于海产鱼中，主要存在于海产鱼中，A2主要存在于淡水鱼中。主要存在于淡水鱼中。在植物中不含已形成的维生素在植物中不含已形成的维生素A，在黄、绿、红色植物中含有，在黄、绿、红色植物中含有类胡萝卜素，其中一部分可在体内转变成维生紊类胡萝卜素，其中一部分可在体内转变成维生紊A的类胡萝卜素的类胡萝卜素称为维生素称为维生素A原，如原，如-胡萝卜素、胡萝卜素、-l胡萝卜素、胡萝卜素、-胡萝卜素等。目胡萝卜素等。目前已经发现的类胡萝卜素约前已经发现的类胡萝卜素约600种，仅有约种，仅有约1/10为维生素为维生素A原。原。第3页，本讲稿共14页维生素维生素A 的功能：的功能：
4、l维持正常视觉维持正常视觉l维持上皮的正常生长与分化维持上皮的正常生长与分化l促进生长发育促进生长发育l抑癌作用抑癌作用l维持机体正常免疫功能维持机体正常免疫功能供给量与来源：供给量与来源：l1989年年RDA中成人每人每天摄入维生素中成人每人每天摄入维生素800ug视黄醇当量。视黄醇当量。l1992年全国营养调查表明，我国城乡居民视黄醇当量平均摄入量仅年全国营养调查表明，我国城乡居民视黄醇当量平均摄入量仅为为476ug，其中约，其中约23来自植物性食物。来自植物性食物。l维生素维生素A最好的来源是各种动物肝脏、鱼肝油、鱼卵、全奶、最好的来源是各种动物肝脏、鱼肝油、鱼卵、全奶、奶油、禽蛋等；维
5、生素奶油、禽蛋等；维生素A原的良好来源是深色蔬菜和水果，原的良好来源是深色蔬菜和水果，如冬寒菜、菠菜、首宿、空心莱、莴笋叶、芹菜叶、胡萝卜、如冬寒菜、菠菜、首宿、空心莱、莴笋叶、芹菜叶、胡萝卜、豌豆苗、红心红薯、椒及水果中的芒果、杏子及柿子等。豌豆苗、红心红薯、椒及水果中的芒果、杏子及柿子等。第4页，本讲稿共14页（一）三氯化锑比色法（一）三氯化锑比色法1 原理原理 维生素维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，生成蓝色物质，其颜色深浅与溶液中所含维生生成蓝色物质，其颜色深浅与溶液中所含维生素素A的含量成正比。的含量成正比。该蓝色物质不稳定，需在一定时间内（该蓝
6、色物质不稳定，需在一定时间内（6秒）秒）用分光光度计于用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。波长处测定其吸光度。2 仪器仪器 实验室常用设备实验室常用设备 分光光度计分光光度计 回流冷凝装置回流冷凝装置 3 操作步骤操作步骤维生素维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。光线下进行，或用棕色玻璃仪器。第5页，本讲稿共14页3.1样品处理：样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。3.1.1皂化法：皂化法：适用于维生素适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干
7、扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。损失。l皂化：根据样品中维生素皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取含量的不同，称取0.55g样样品于三角瓶中，加入品于三角瓶中，加入10mL 1:1氢氧化钾及氢氧化钾及2040mL乙醇，乙醇，于电热板上回流于电热板上回流30min至至皂化完全皂化完全为止。为止。提取：提取：洗涤：洗涤：浓缩：浓缩：第6页，本讲稿共14页水层水层皂化瓶内混合物皂化瓶内混合物分液漏斗分液漏斗1 1号号水洗水洗乙醚洗乙醚洗振振摇，静置，分，静置，分层水层水层醚层醚层分液漏斗分液漏斗2 2号号振振摇，静置，分，静置，分层醚层
8、醚层水层水层分液漏斗分液漏斗3 3号号振振摇，静置，分，静置，分层醚层醚层分液漏斗分液漏斗1 1号号提提取取第7页，本讲稿共14页振振摇，静置，分，静置，分层分液漏斗分液漏斗1 1号号水洗水洗醚层水水层KOHKOH溶液洗溶液洗振振摇，静置，分，静置，分层醚层KOHKOH溶液溶液层水洗水洗振振摇，静置，分，静置，分层醚层水水层振振摇，静置，分，静置，分层水洗水洗醚层水水层净净化化第8页，本讲稿共14页分液漏斗分液漏斗醚层乙乙醚洗洗涤水浴蒸水浴蒸馏减减压抽干抽干氯仿定容（仿定容（5mL)5mL)无水硫酸无水硫酸钠浓浓缩缩第9页，本讲稿共14页3.1.2研磨法研磨法：适用于每克样品维生素：适用于每克
9、样品维生素A含量大于含量大于510g样品的测样品的测定，如肝的分析。（步骤简单，省时，结果准确。）定，如肝的分析。（步骤简单，省时，结果准确。）l研磨：研磨：精确称精确称25g样品，放入盛有样品，放入盛有35倍样品重量的无水硫酸钠倍样品重量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。l提取：提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50100mL乙醚。紧压盖子，用力振摇乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素，使样品中维生素A溶溶于乙醚中。使其自行澄清于乙醚中。使
10、其自行澄清(大约需大约需12h)，或离心澄清，或离心澄清(因乙醚易挥发因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中浴中)l浓缩：浓缩：取澄清提取乙醚液取澄清提取乙醚液25mL，放入比色管中，在，放入比色管中，在7080水浴上抽气蒸干。立即加入水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。三氯甲烷溶解残渣。第10页，本讲稿共14页3.2 标准曲线制备标准曲线制备 准确取一定量的维生素准确取一定量的维生素A标准液于标准液于45个容量瓶中，个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。以三氯甲烷配制标准系列。取相同数量比
11、色管顺次取取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使三氯甲烷和标准系列使用液用液1mL，各管加入乙酸酐，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色系列。滴，制成标准比色系列。于于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化三氯化锑三氯甲烷溶液。于锑三氯甲烷溶液。于6s内内测定吸光度。测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以维生素以吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准含量为横坐标绘制标准曲线图。曲线图。第11页，本讲稿共14页3.3 样品测定样品测定于一比色管中加入
12、于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入三氯甲烷，加入1滴乙酸酐为滴乙酸酐为空白液。空白液。另一比色管中加入另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加三氯甲烷，其余比色管中分别加入入1mL样品溶液及样品溶液及1滴乙酸酐。滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。其余步骤同标准曲线的制备。4 结果计算结果计算 第12页，本讲稿共14页（二）（二）高高效液相色谱法效液相色谱法1.原理原理样品中的维生素样品中的维生素A及维生素及维生素E经皂化提取处经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法用高效液相色谱法C18反相柱将维生素反相柱将维生素A和维生和维生素素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。测定。第13页，本讲稿共14页2 试剂试剂 无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处理。无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处理。维生素维生素A标准溶液、维生素标准溶液、维生素E标准溶液标准溶液 内标物溶液：内标物溶液：10g10g苯并苯并e芘芘/mL3 仪器和设备仪器和设备高压液相色谱仪带紫外分光检测器。高压液相色谱仪带紫外分光检测器。第14页，本讲稿共14页