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1、荧光分光光度法测定药液维生素的含量第1页，本讲稿共14页实验原理实验原理实验原理实验原理荧光分析法荧光分析法 常常常常温温温温下下下下，处处处处于于于于基基基基态态态态的的的的分分分分子子子子吸吸吸吸收收收收一一一一定定定定的的的的紫紫紫紫外外外外可可可可见见见见光光光光的的的的辐辐辐辐射射射射能能能能成成成成为为为为激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子，激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子通通通通过过过过无无无无辐辐辐辐射射射射跃跃跃跃迁迁迁迁至至至至第第第第一一一一激激激激发发发发态态态态的的的的最最最最低低低低振振振振动动动动能能能能级级级级，再再再再以以以以辐辐辐辐射射射射跃跃
2、跃跃迁迁迁迁的的的的形形形形式式式式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度在稀溶液中，荧光强度在稀溶液中，荧光强度在稀溶液中，荧光强度I IF F与物质的浓度与物质的浓度与物质的浓度与物质的浓度c c有以下的关系：有以下的关系：有以下的关系：有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强
3、度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。第2页，本讲稿共14页a.a.与紫外与紫外与紫外与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。敏度。敏度。敏度。b.b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光
4、谱来鉴定物质。光谱来鉴定物质。光谱来鉴定物质。光谱来鉴定物质。c.c.所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。荧光分析法的特点荧光分析法的特点第3页，本讲稿共14页激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长选最大发射波长选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的，化合物发射的荧光强度与照射光波长的，化合物发射的荧光强度与照射光波长的，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。关系
5、曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。发发发发射射射射光光光光谱谱谱谱：固固固固定定定定激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长(选选选选最最最最大大大大激激激激发发发发波波波波长长长长),),化化化化合合合合物物物物发发发发射射射射的的的的荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度与与与与发发发发射射射射光光光光波波波波长关系曲线。长关系曲线。长关系曲线。长关系曲线。固固固固定定定定发发发发射射射射光光光光波波波波长长长长进进进进行行行行激激
6、激激发发发发光光光光波波波波长长长长扫扫扫扫描描描描，找找找找出出出出最最最最大大大大激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长，然然然然后后后后固固固固定定定定激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长进进进进行行行行荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射波波波波长长长长扫扫扫扫描描描描，找找找找出出出出最最最最大大大大荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射波波波波长长长长。激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长和和和和发发发发射射射射荧荧荧荧光光光光波波波波长长长长的的的的选选选选择择择择是是是是本实验的关键。本实验的关键。本实验的关键。本实验的关键。荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱激发光谱激发光谱激发
7、光谱激发光谱发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱第4页，本讲稿共14页荧光分析仪器荧光分析仪器 常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：五部分构成，如下图所示：五部分构成，如下图所示：五部分构成，如下图所示：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要
8、差别有两点：a.a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。干扰。干扰。干扰。液槽显示器单色器检测器I0IIf光源单色器第5页，本讲稿共14页a.a.光光
9、光光源源源源：在在在在荧荧荧荧光光光光计计计计中中中中常常常常用用用用卤卤卤卤钨钨钨钨灯灯灯灯作作作作光光光光源源源源；荧荧荧荧光光光光分分分分度度度度计计计计常常常常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。采用高压汞灯或氙弧灯做光源。采用高压汞灯或氙弧灯做光源。采用高压汞灯或氙弧灯做光源。b.b.单单单单色色色色器器器器：荧荧荧荧光光光光计计计计的的的的单单单单色色色色器器器器是是是是滤滤滤滤光光光光片片片片，只只只只能能能能用用用用于于于于定定定定量量量量分分分分析析析析；荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计采采采采用用用用两两两两个个个个光光光光栅栅栅栅单单单单色色色色器器器器，
10、可可可可获获获获得得得得激发光谱和荧光光谱。激发光谱和荧光光谱。激发光谱和荧光光谱。激发光谱和荧光光谱。c.c.检检检检测测测测器器器器：荧荧荧荧光光光光计计计计采采采采用用用用光光光光电电电电管管管管作作作作检检检检测测测测器器器器；荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计采用光电倍增管作检测器。计采用光电倍增管作检测器。计采用光电倍增管作检测器。计采用光电倍增管作检测器。仪器部件仪器部件第6页，本讲稿共14页 维生素维生素维生素维生素B B2 2（又叫核黄素，（又叫核黄素，（又叫核黄素，（又叫核黄素，VBVB2 2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构）
11、是橘黄色无臭的针状结晶，其结构）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：式为：式为：式为：维生素维生素维生素维生素B B2 2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。光照易分解，对热稳定。光照易分解，对热稳定。光照易分解，对热稳定。药液维生素药液维生素药液维生素药液维生素B B B B2 2 2 2含量的测定含量的测定含量的测定含量的测定第7页，本讲稿共14页 维维维维生生生生素素素素B B2
12、2溶溶溶溶液液液液在在在在430430440 440 nmnm蓝蓝蓝蓝光光光光的的的的照照照照射射射射下下下下，发发发发出出出出绿绿绿绿色色色色荧荧荧荧光光光光，其其其其峰峰峰峰值值值值波波波波长长长长为为为为525 525 nmnm。VBVB2 2的的的的荧荧荧荧光光光光在在在在pH=6pH=67 7时时时时最最最最强强强强，在在在在pH=11pH=11时时时时消消消消失失失失。维维维维生生生生素素素素B B2 2在在在在碱碱碱碱性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中经经经经光光光光线线线线照照照照射射射射会会会会发发发发生生生生分分分分解解解解而而而而转转转转化化化化为为为为光光光光黄黄黄黄素素
13、素素，光光光光黄黄黄黄素素素素的的的的荧荧荧荧光光光光比比比比核核核核黄黄黄黄素素素素的的的的荧荧荧荧光光光光强强强强的的的的多多多多，故故故故测测测测VBVB2 2的的的的荧荧荧荧光光光光时时时时溶溶溶溶液液液液要要要要控控控控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。制在酸性范围内，且在避光条件下进行。制在酸性范围内，且在避光条件下进行。制在酸性范围内，且在避光条件下进行。光黄素光黄素光黄素光黄素第8页，本讲稿共14页实验预习实验预习实验预习实验预习v v预习荧光分光光度法测定维生素预习荧光分光光度法测定维生素预习荧光分光光度法测定维生素预习荧光分光光度法测定维生素B B2 2的分析原理。的分析
14、原理。的分析原理。的分析原理。v v了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B B2 2 的方的方的方的方法。法。法。法。第9页，本讲稿共14页F96F96型荧光光度计（上海棱光分析仪器有限公司）型荧光光度计（上海棱光分析仪器有限公司）型荧光光度计（上海棱光分析仪器有限公司）型荧光光度计（上海棱光分析仪器有限公司）5 mL5 mL吸量管吸量管吸量管吸量管1 1只，只，只，只，2 mL2 mL吸量管吸量管吸量管吸量管1 1只，只，只，只，50 mL50 mL容量瓶容量瓶容量瓶容量瓶7 7只只只
15、只10.0gmL10.0gmL-1-1VBVB2 2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（ARAR），），），），药用药用药用药用VBVB2 2试样试样试样试样仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂第10页，本讲稿共14页1.1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。化仪器。化仪器。化仪器。2.2.仪器初始化完毕后，在工
16、作界面上选择测量项目，设置适当的仪仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长器参数：激发波长器参数：激发波长器参数：激发波长=440 nm=440 nm（本仪器只有（本仪器只有（本仪器只有（本仪器只有356 nm 356 nm），发射波长），发射波长），发射波长），发射波长=540=540 nmnm。3.3.样品测定。样品测定。样品测定。样品测定。4.4.退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。退出主程
17、序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。基本操作基本操作第11页，本讲稿共14页1.1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：在六个干净的在六个干净的在六个干净的在六个干净的50 mL50 mL容量瓶中，分别吸取容量瓶中，分别吸取容量瓶中，分别吸取容量瓶中，分别吸取0.500.50、1.001.00、1.501.50，2.00 2.00、2.502.50和和和和3.00 mL VB3.00 mL VB2 2标准溶液，各加
18、入标准溶液，各加入标准溶液，各加入标准溶液，各加入2.00 mL2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，冰乙酸，稀释至刻度，冰乙酸，稀释至刻度，冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。2.2.未知试样的测定未知试样的测定未知试样的测定未知试样的测定:移取移取移取移取0.1 mL0.1 mL试样试样试样试样,用少量水溶解后转入用少量水溶解后转入用少量水溶解后转入用少量水溶解后转入50 mL50 mL容量瓶中，加容量瓶中，加容量瓶中，加容量瓶中，加2.00
19、2.00 mLmL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。光强度。光强度。光强度。实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤第12页，本讲稿共14页1.1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2.2.根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其根据待测液的荧光强
20、度，从标准工作曲线上求得其根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中浓度，计算出试样中浓度，计算出试样中浓度，计算出试样中VBVB2 2含量。含量。含量。含量。数据处理数据处理数据处理数据处理第13页，本讲稿共14页1.1.解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。2.2.维维维维生生生生素素素素B B2 2在在在在pHpH6 67 7时时时时荧荧荧荧光光光光最最最最强强强强，本本本本实实实实验验验验为为为为何何何何在在在在酸酸酸酸性溶液中测定？性溶液中测定？性溶液中测定？性溶液中测定？注意事项和问题注意事项和问题第14页，本讲稿共14页