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1、第六章第六章 特殊细胞培养概要特殊细胞培养概要一、上皮细胞培养一、上皮细胞培养二、神经细胞培养二、神经细胞培养三、肿瘤细胞培养三、肿瘤细胞培养本章内容提要本章内容提要 体内组织细胞在体外培养时，所需培养环体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同。定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同。上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织。但是，上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生
2、长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。一、上皮细胞培养一、上皮细胞培养上皮细胞培养的特殊条件上皮细胞培养的特殊条件微生物污染的防范微生物污染的防范特殊的生长基质特殊的生长基质特殊的培养基特殊的培养基成纤维细胞的去除成纤维细胞的去除表皮细胞培养表皮细胞培养乳腺组织培养乳腺组织培养胃上皮细胞培养胃上皮细胞培养肝细胞培养肝细胞培养内皮细胞培养内皮细胞培养毛细血管内皮细胞培养毛细血管内皮细胞培养实例实例实例实例表皮细胞培养表皮细胞培养1取材：取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.51平方厘米小块
3、。2EDTA处理：处理：先置入0.02EDTA中室温置5分钟。3冷消化：冷消化：换入0.25胰蛋白酶中，置4过夜。4分离：分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。5温消化：温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25胰蛋白酶中，37再消化3060分钟。6用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。7培养液：培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。实例内皮细胞培养内皮细胞培养1取产后的新鲜脐带。如不立即培养可以保存于4中，但不宜超过12小时。无菌剪取长1015厘米一段。其它如胚胎和幼
4、体动物的大血管，亦可用于培养。2先用三通注射器吸温PBS液注入脐带的静脉中，洗除残血，注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流。3用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化310分钟。4吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中，为获取更多细胞，可再注入温PBS冲洗23次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心。5吸除上清，加1640培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养，顺利时23天内细胞即可长成单层。二、神经细胞培养二、神经细胞培养Harrison 1907神经细胞（神经细胞（神经元神经元）不易培养
5、，只有在适）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象。一定程度的分化，长出突起等现象。神经元细胞神经元细胞培养的特殊条件培养的特殊条件极高的营养条件：DMEM:Ham F12=1：1培养底物需要经过胶原或聚L-赖氨酸的特殊处理加入神经生长因子、有丝分裂抑制剂：阿糖胞苷、5-氟脱氧尿嘧啶神经胶质细胞神经胶质细胞是神经组织中比较容易培是神经组织中比较容易培养的成分。养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，
6、不仅能获得生长的胶质细胞，也培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用的敏感性，可用ROUS病毒和病毒和SV4等诱等诱发转化。发转化。神经胶质细胞神经胶质细胞 1获取脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等获取脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，置入纤维成分，置入Hanks液中漂洗液中漂洗12次后，次后，置于置于3050倍的倍的Hanks液中，脑组织比较柔液中，脑组织比较柔软，反复吹打即可
7、制成细胞悬液。软，反复吹打即可制成细胞悬液。2为排除脂肪成分和其它碎块，把悬液注入为排除脂肪成分和其它碎块，把悬液注入离心管中，在室温直立离心管中，在室温直立510分钟后，细胞或分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复二三次可获得液表层，吸除上清，如此反复二三次可获得较多的细胞成分。较多的细胞成分。方法方法 3向末次沉淀物中加入适量营养液，通过向末次沉淀物中加入适量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞并调整好细胞纱网或纱布滤过，计数细胞并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置密度，接种入培养瓶或皿中，置5CO2温温箱中
8、培养。箱中培养。4细胞生长汇合后，可用细胞生长汇合后，可用0.25胰蛋白胰蛋白酶消化法做传代处理，加消化液的量以能酶消化法做传代处理，加消化液的量以能覆盖细胞层即可，待细胞开始从瓶壁脱离覆盖细胞层即可，待细胞开始从瓶壁脱离（平均（平均510分钟），加入含有血清培养分钟），加入含有血清培养液，吹打制成细胞悬液。液，吹打制成细胞悬液。注意注意神经细胞只能增大，而不能增殖，只能神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。但胶质细胞可以，
9、神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期在培养过程中，早期9-12d 时，有较多时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。成突触。三、肿瘤细胞培养三、肿瘤细胞培养肿瘤细胞在细胞培养中占有核心的位置，肿瘤细胞在细胞培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞肿瘤
10、对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。（）体外培养肿瘤细胞生物学特性体外培养肿瘤细胞生物学特性永生性永生性形态和性状形态和性状侵袭性侵袭性生长增殖生长增殖细胞遗传细胞遗传异质性异质性成瘤性成瘤性相关图片相关图片食管癌细胞株表达食管癌细胞株表达MMP2：1.细胞种类：食管癌细胞株；细胞种类：食管癌细胞株；2.培养的天数：培养的天数：2d;细胞倍增时间细胞倍增时间-24h左右；左右；3.
11、放大倍速：倒置荧光显微镜，放大倍速：倒置荧光显微镜，100倍；倍；4.培养基种类：培养基种类：1640+10%胎牛血清；胎牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞贴壁生细胞贴壁生长；长；6.图片目的：鉴定食管癌细胞表达图片目的：鉴定食管癌细胞表达MMP-2，胞浆中绿色荧光为，胞浆中绿色荧光为MMP-2，细胞核红色荧光为，细胞核红色荧光为PI复染。复染。SGC7901细胞细胞1.细胞种类：人胃肿瘤细胞；细胞种类：人胃肿瘤细胞；2.培养的天数：培养的天数：2天；天；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：DMEM+10%小牛血清；小牛血清；5
12、.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长细胞呈梭型贴壁生长 Hepg21.细胞种类：人肝肿瘤细胞细胞种类：人肝肿瘤细胞2.培养的天数：复苏后培养的天数：复苏后12小时；小时；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：DMEM+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长细胞呈梭型贴壁生长 组织细胞淋巴瘤组织细胞淋巴瘤1.细胞种类：细胞种类：U9372.培养的天数：培养的天数：2d；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：1640+10%胎牛血清；胎牛血清
13、；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈圆形，悬浮生长细胞呈圆形，悬浮生长 右图示转染绿色荧光蛋白后荧光显微镜视图右图示转染绿色荧光蛋白后荧光显微镜视图 人前列腺癌细胞人前列腺癌细胞1.细胞种类：细胞种类：PC32.培养的天数：培养的天数：3d；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：1640+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈不规则梭形，贴壁生长细胞呈不规则梭形，贴壁生长 人原髓细胞白血病人原髓细胞白血病1.细胞种类：细胞种类：HL-602.培养的天数：培养的天数：1d-4d；3.放大倍速：倒置显微镜
14、放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：1640+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈圆形，悬浮生长细胞呈圆形，悬浮生长（常见悬浮生长细胞：（常见悬浮生长细胞：U937/HL60/THP-1）大鼠大鼠 肾上腺嗜铬细胞瘤细胞肾上腺嗜铬细胞瘤细胞1.细胞种类：细胞种类：PC-12 2.培养的天数：培养的天数：1d-4d；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：1640+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈不规则形态，贴壁生长细胞呈不规则形态，贴壁生长，生长，生长速
15、度快速度快 人乳腺癌细胞人乳腺癌细胞1.细胞种类：细胞种类：MCF-72.培养的天数：培养的天数：1d-4d；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：1640+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈扁梭形，贴壁生长细胞呈扁梭形，贴壁生长人肺癌细胞人肺癌细胞1.细胞种类：细胞种类：A549；2.培养的天数：培养的天数：1d4d；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，贴壁生
16、长细胞呈梭形，有伪足，贴壁生长 人鳞癌细胞人鳞癌细胞Tca8113细胞种类：人口腔鳞癌细胞细胞种类：人口腔鳞癌细胞建细胞系单位：上海第二医科大学附属第九人民医院建细胞系单位：上海第二医科大学附属第九人民医院培养天数：传代后培养天数：传代后24h放大倍数：荧光显微镜放大倍数：荧光显微镜10培养基：培养基：1640+10%小牛血清小牛血清染色方法：染色方法：AO+EB双染双染（二）肿瘤细胞培养要点（二）肿瘤细胞培养要点1取材取材：人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织2培养基培养基：培养基RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A 血清 生长因子、激素、蛋白质3成纤维细胞的排除成纤维细胞的排除4.提
17、高肿瘤细胞培养存活率和生长率提高肿瘤细胞培养存活率和生长率成纤维细胞的排除方法成纤维细胞的排除方法1机械刮除法：机械刮除法：用不锈钢丝末端插有橡用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）灼器刮除）程序：程序：（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸）刮除：弃掉培养液，把无
18、菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空无标记空（3）用）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；的细胞；（4）注入培养液继续培养，如发现仍有）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。掉为止。2反复贴壁法：反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢贴壁速度慢的的特点，并结合使用不加血清的营养液，把特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传
19、代相同。类细胞相互分离，操作方法与传代相同。过程：过程：（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，胰酶消化后，Hanks液冲洗液冲洗2次，加入不含血清的次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；培养液，吹打制成细胞悬液；（2）取编号为此）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液三个培养瓶；首先把悬液接种入接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养培养瓶中。置温箱中静止培养520分钟分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向培养瓶中后；向
20、A瓶中瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；补充少许完全培养液置温箱中继续培养；（3）培养）培养B瓶中细胞瓶中细胞520分钟后，接处理分钟后，接处理A的方法，的方法，把培养液注入把培养液注入C培养瓶中；再向培养瓶中；再向B瓶中补加完全培瓶中补加完全培养基。养基。A瓶主要为成纤维细胞，瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞瓶可能主要为癌细胞 3消化排除法：消化排除法：胰蛋白酶消化法 胶原酶消化法4其它方法：其它方法：有人发现聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖聚蔗糖制备成比重1.0251.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在2
21、3中800g离心 10分种。在比重1.0251.050层为成纤维细胞，在比重1.0501.085 层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。方法方法因素因素组织细胞胞选择性附着性附着选择性附着底物性附着底物汇合合饲细胞胞层选择性培养基性培养基 胰蛋白胰蛋白酶胶原胶原酶聚丙聚丙烯酰胺胺 聚四氟乙聚四氟乙烯（Teflon）胶原（猪皮）胶原（猪皮）小鼠小鼠3T3人胎小人胎小肠D-缬氨酸（氨酸（Valine）MCDB-710MCDB-153 Phenobarbitone胚胎小胚胎小肠、心肌、心肌、表皮表皮乳癌乳癌各种各种肿瘤瘤转化化细胞胞表皮表皮细胞胞
22、表皮表皮正常和正常和恶性乳腺性乳腺上皮上皮结肠癌癌肾组织乳腺乳腺表皮表皮肝肝细胞胞提高肿瘤细胞培养存活率和生长率的措施提高肿瘤细胞培养存活率和生长率的措施1适宜底物：适宜底物：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。2生长因子：生长因子：应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。3.动物体媒介培养方法：动物体媒介培养方法：（1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks 液洗净血污，切成13 毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块；（2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织；（3）进行体外培养。（4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。