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1、细胞培养污染细胞培养污染简简 介介凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染细胞污染不能完全被消除，但能减少其发细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性生的频率和后果的严重性细胞污染的分类细胞污染的分类 物理污染物理污染 化学污染化学污染 生物污染（支原体污染）生物污染（支原体污染）提提 纲纲控制污染控制污染 掌握良好的无菌操作技术掌握良好的无菌操作技术 建立细胞库建立细胞库 合理应用抗生素合理应用抗生素 保持工作区清洁保持工作区清洁 建立良好的规章制度建立良好的规章制度 检
2、测细胞污染检测细胞污染温度温度孵箱放在温度较恒定的房间中孵箱放在温度较恒定的房间中培养液从冰箱取出后在室温放置培养液从冰箱取出后在室温放置放射线放射线试剂周围不能放同位素试剂周围不能放同位素振动振动孵箱周围不能放引起振动的设备孵箱周围不能放引起振动的设备辐射辐射试剂不要放在带有玻璃门的冰箱中试剂不要放在带有玻璃门的冰箱中物物 理理 污污 染染 化学污染化学污染 血清血清 培养液及试剂培养液及试剂 水水 培养用器皿培养用器皿 孵箱孵箱化化 学学 污污 染染化化 学学 污污 染染 培养液及试剂培养液及试剂 选用纯度最高的试剂选用纯度最高的试剂 经过权威机构认定经过权威机构认定 正确的储存方法正确的
3、储存方法 血清血清 新购买的血清用之前要试新购买的血清用之前要试 应选用同一批次的血清应选用同一批次的血清 水水用来配液和清洗容器用来配液和清洗容器传统用双蒸和三蒸水传统用双蒸和三蒸水现在用纯水仪现在用纯水仪millipore超纯水放置过久纯度下降超纯水放置过久纯度下降化化 学学 污污 染染 容器容器 生产过程中有毒物质残留生产过程中有毒物质残留 消毒剂和清洗剂的残留消毒剂和清洗剂的残留 铝箔和包裹纸残留铝箔和包裹纸残留化化 学学 污污 染染 孵箱孵箱 co2混有有毒气体混有有毒气体 消毒剂和清洗剂的残留消毒剂和清洗剂的残留生生 物物 污污 染染 生物污染生物污染容易发现的生物污染包括细菌、霉
4、容易发现的生物污染包括细菌、霉菌和酵母菌和酵母不容易被发现的生物污染包括病毒、不容易被发现的生物污染包括病毒、原虫、昆虫、支原体和其它细胞系原虫、昆虫、支原体和其它细胞系生生 物物 污污 染染对实验人员是一个潜在的危对实验人员是一个潜在的危险因素险因素细胞系交叉污染细胞系交叉污染污染在这是个错误的用词污染在这是个错误的用词难于发现难于发现若出现传代细胞的生长速度若出现传代细胞的生长速度异常异常，考虑交叉污染，考虑交叉污染同一时间只传同一种细胞同一时间只传同一种细胞每种细胞要有单独的液体每种细胞要有单独的液体建立细胞库每三个月更换一建立细胞库每三个月更换一次细胞次细胞细菌、霉菌和酵母细菌、霉菌和
5、酵母无抗生素污染易被发现无抗生素污染易被发现抗生素存在易造成隐性污抗生素存在易造成隐性污染染隐性污染引起严重后果隐性污染引起严重后果病毒病毒最难发现和清除最难发现和清除严格的宿主性严格的宿主性自限性自限性 支原体（杂草）支原体（杂草）生生 物物 污污 染染污染严重污染严重难发现难发现 难去除难去除显微镜看不到显微镜看不到不引起培养液浑浊和不引起培养液浑浊和PHPH改变改变营养要求高不容易用传统的微生营养要求高不容易用传统的微生物培养法检测到物培养法检测到不能通过过滤清除不能通过过滤清除大多数抗生素对其无效大多数抗生素对其无效 支原体检测方法支原体检测方法生生 物物 污污 染染方法敏感性优点缺点
6、直接DNADNA染色(如Hoechst33258)Hoechst33258)低快速，便宜需要荧光显微镜结果不易解释指示细胞上间接DNADNA染色(如 Vero)Vero)中放大污染结果易解释费时免疫荧光单克隆抗体易操作灵敏需要荧光显微镜肉汤和琼脂培养高灵敏慢 需要专业解释ELISAELISA中快速检查种类有限PCRPCR中- -高特异性强快速需要PCRPCR设备1 1 分子量对照分子量对照2 2 阴性对照阴性对照3-8 3-8 原有细胞的悬液原有细胞的悬液9 9 阳性对照阳性对照1 1 分子量对照分子量对照2 2 阴性对照阴性对照3-8 3-8 新细胞的悬液新细胞的悬液9 9 阳性对照阳性对照
7、VenorGeM试剂盒试剂盒生生 物物 污污 染染 支原体支原体树树 立立 “预预 防防 为为 主主” 的的 思思 想想保证细胞来源干净保证细胞来源干净确保基质和器材无菌确保基质和器材无菌严格无菌操作严格无菌操作细胞培养时避免交谈细胞培养时避免交谈操作结束时消毒台面操作结束时消毒台面每船每船1515代的细胞应更换代的细胞应更换所有细胞培养材料丢弃前应高压消毒所有细胞培养材料丢弃前应高压消毒控控 制制 污污 染染良好的无菌操作良好的无菌操作合理利用抗生素合理利用抗生素建立细胞库建立细胞库保持工作区清洁保持工作区清洁良好的规章制度良好的规章制度细胞污染的检测细胞污染的检测 良好的无菌操作良好的无菌
8、操作所有玻璃器皿和培养液与试剂的配制应严格无菌所有玻璃器皿和培养液与试剂的配制应严格无菌避免溢出、溅出和气溶胶；避免溢出、溅出和气溶胶；吸入或吸出液体时避免倾倒；吸入或吸出液体时避免倾倒；吸入或吸出液体时，不要触碰细胞培养瓶的瓶口；吸入或吸出液体时，不要触碰细胞培养瓶的瓶口；液体应分装并置液体应分装并置4-84-8o oC C保存；保存；每种细胞应使用单独的液体；每种细胞应使用单独的液体；清洁区和污染区的材料应单独处理；清洁区和污染区的材料应单独处理；控控 制制 污污 染染 合理利用抗生素合理利用抗生素过度依赖抗生素会使人们忽略无菌操作过度依赖抗生素会使人们忽略无菌操作滥用抗生素常导致耐药菌的
9、产生滥用抗生素常导致耐药菌的产生牢记抗生素不能代替无菌操作牢记抗生素不能代替无菌操作控控 制制 污污 染染 建立细胞库建立细胞库减少从主管单位获得细胞的运输费减少从主管单位获得细胞的运输费 冻存的细胞生物性状不发生改变冻存的细胞生物性状不发生改变消除了隐蔽污染的潜在危害消除了隐蔽污染的潜在危害控控 制制 污污 染染 良好的规章制度良好的规章制度只有相关人员才可进入细胞培养区只有相关人员才可进入细胞培养区 细胞培养区必须和其他区域分开细胞培养区必须和其他区域分开 每个细胞培养区应布局合理，保证所需物品就近放置，在处每个细胞培养区应布局合理，保证所需物品就近放置，在处理细胞时避免不必要的走动理细胞
10、时避免不必要的走动 细胞培养区应避免使用水池，从而避免微生物污染细胞培养区应避免使用水池，从而避免微生物污染 控控 制制 污污 染染控控 制制 污污 染染 保持工作区清洁保持工作区清洁常规清洗地面和台面常规清洗地面和台面COCO2 2孵箱孵箱每每2-32-3个月消毒清洗孵箱个月消毒清洗孵箱所有溅出或溢出的液滴应所有溅出或溢出的液滴应立即擦拭并消毒立即擦拭并消毒 每周孵箱内水盘需彻底消每周孵箱内水盘需彻底消毒清洗毒清洗定期清洁水浴箱定期清洁水浴箱生物安全柜生物安全柜每次使用后应清洁和消毒每次使用后应清洁和消毒安全柜的内表面安全柜的内表面定期消毒安全柜工作面下定期消毒安全柜工作面下层的盘子；层的盘子； 及时清理废弃物，高压感染材及时清理废弃物，高压感染材料料控控 制制 污污 染染 细胞污染的检测细胞污染的检测支原体的检测支原体的检测其它生物污染的检测其它生物污染的检测使用传统的微生物学检测使用传统的微生物学检测方法方法化学污染的检测化学污染的检测常被误认为生物污染常被误认为生物污染要靠逐一替换的方法确定要靠逐一替换的方法确定化学污染的来源化学污染的来源