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1、会计学1实验大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验大肠杆菌感受态细胞的制备及转化内容一：内容一：大肠杆菌大肠杆菌感受态细胞的制备感受态细胞的制备实验目的实验原理实验仪器、材料、试剂实验步骤 1 2 3 4注意事项思考题 5 6第1页/共28页实实 验验 目目 的的n n 掌握感受态细胞的概念及其意义。掌握感受态细胞的概念及其意义。n n 掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。第2页/共28页实实 验验 原原 理理 感受态：受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。制备感受态的
2、细胞一般选择对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。常用的感受态制备方法包括KCl、CaCl2等方法；后者因为操作简便且符合大多数的分子克隆要求，因而被广泛采用。第3页/共28页 CaClCaCl2 2 法的基本原理：法的基本原理：法的基本原理：法的基本原理：细菌处于低温（细菌处于低温（0 0）和低渗的）和低渗的CaClCaCl2 2溶液溶液中，菌体膨胀，中，菌体膨胀，细胞膜的通透性细胞膜的通透性发生了暂时发生了暂时性的改变，转化混合物中的性的改变，转化混合物中的DNADNA形成抗形成抗DNaseDNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，钙磷酸复合物黏附于菌体
3、表面，在在4242进行短时间的热激处理，促进进行短时间的热激处理，促进DNADNA的的吸收。吸收。实实 验验 原原 理理第4页/共28页 CaCl CaCl2 2 法简便易行，法简便易行，用用 CaClCaCl2 2法制备的法制备的感受态细胞，感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒可使每微克超螺旋质粒 DNADNA产生产生5 5 10106 6-2-2 10107 7个转化菌落个转化菌落。在实际工。在实际工作中，每微克有作中，每微克有10105 5以上的转化菌落足以满以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。足一般的克隆实验。制备出的感受态细胞暂时不用时，制备出的感受态细胞暂时不用时，加入加入占总体积占
4、总体积1515的无菌甘油于的无菌甘油于-70-70，可以保，可以保存半年存半年。实实 验验 原原 理理第5页/共28页提高转化效率要考虑几个重要因素：提高转化效率要考虑几个重要因素：提高转化效率要考虑几个重要因素：提高转化效率要考虑几个重要因素：实实 验验 原原 理理 1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4的培养菌，最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5107 个/ml左右。第6页/共28页 2 2、质粒的质量和浓度：、质粒的质
5、量和浓度：用于转化的质粒用于转化的质粒DNADNA应主应主要是超螺旋态要是超螺旋态DNADNA。转化效率与外源转化效率与外源DNADNA的浓度的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源在一定范围内成正比，但当加入的外源DNADNA的量过的量过多或体积过大时，转化效率就会降低多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng 1ng的超螺旋态的超螺旋态DNADNA即可使即可使50l 50l 的感受态细胞的感受态细胞达到饱和达到饱和。一般情况下，。一般情况下，DNADNA溶液的体积不应超过溶液的体积不应超过感受态细胞体积的感受态细胞体积的5 5。实实 验验 原原 理理第7页/共28页 3 3、试剂的质量：、试
6、剂的质量：所用的试剂，如所用的试剂，如CaClCaCl2 2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，并用微孔滤膜过滤灭菌，最好分制，并用微孔滤膜过滤灭菌，最好分装保存于干燥的冷暗处。装保存于干燥的冷暗处。实实 验验 原原 理理第8页/共28页 4 4、防止杂菌和杂、防止杂菌和杂DNADNA的污染：的污染：整个操作过整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，离心管，tip tip头等最好是新的，并经高压灭头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、止被
7、其它试剂、DNADNA酶或杂酶或杂DNADNA所污染，所污染，否则均会影响转化效率或杂否则均会影响转化效率或杂DNADNA的转入，的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。实实 验验 原原 理理第9页/共28页实验仪器、材料、试剂实验仪器、材料、试剂1 1、仪器：、仪器：、仪器：、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式 离心机、无菌操作台、微量移液离心机、无菌操作台、微量移液 器、恒温摇床；器、恒温摇床；2 2、材料：、材料：、材料：、材料：菌种菌种E.coliE.coli DH5 DH5；3 3、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：LB
8、LB液体培养基、液体培养基、0.1M CaCl0.1M CaCl2 2。第10页/共28页 1 1、将、将E.coliE.coli DH5 DH5 单菌落接种于单菌落接种于3mlLB3mlLB培培 养液中，养液中，3737震荡培养过夜。震荡培养过夜。2 2、取、取30l30l液体培养液加入液体培养液加入3mlLB3mlLB液体培养液体培养基中，基中，3737下震荡培养，至光密度值下震荡培养，至光密度值 OD OD600600在在0.50.60.50.6之间（之间（5105107 7 个个/ml/ml）。）。3 3、取、取1ml 1ml E.coliE.coli液体培养液于液体培养液于1.5ml
9、1.5ml的离心的离心管中，管中，4000rpm4000rpm，4 4 离心离心 3min3min。实实 验验 步步 骤骤第11页/共28页 4 4、快速的吸除上清，向沉淀中加入、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml1ml冰冰 冷的冷的0.1M CaCl0.1M CaCl2 2溶液，使沉淀充分悬浮，动溶液，使沉淀充分悬浮，动 作要轻柔，置于冰上作要轻柔，置于冰上30min30min，4000rpm4000rpm，4 4 离心离心3min3min。5 5、弃上清，加入、弃上清，加入lml lml 冻存液（含冻存液（含15%15%甘油的甘油的0.1M CaCl0.1M CaCl2 2溶液）溶液，使沉
10、淀充分悬浮，溶液）溶液，使沉淀充分悬浮，以每管以每管0.1ml0.1ml的规格分装的规格分装3 3管，冻存于管，冻存于-80-80 ，可保存，可保存4646个月。个月。实实 验验 步步 骤骤第12页/共28页注注 意意 事事 项项1 1、不要用经过多次转接或储存与、不要用经过多次转接或储存与4 4的培的培养养 菌，最好从菌，最好从-80-80甘油保存的菌种中直甘油保存的菌种中直接接 转接用于制备感受态细胞的菌液。转接用于制备感受态细胞的菌液。2 2、细胞生长密度以刚进入对数生长期时为、细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 宜，可以通过监测培养液的宜，可以通过监测培养液的ODOD600600控制。
11、控制。DH5 DH5 菌株的菌株的ODOD600600为为0.50.5时，细胞密度比时，细胞密度比 较合适。密度过高或不足均会影响转化较合适。密度过高或不足均会影响转化 效率。效率。第13页/共28页注注 意意 事事 项项3 3、进行热激制备感受态细胞时要控制好、进行热激制备感受态细胞时要控制好 时间。时间。4 4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌 体破裂，影响转化。体破裂，影响转化。第14页/共28页思思 考考 题题 1 1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪、影响感受态细胞转化效率的因素有哪 些？些？第15页/共28页内容二：质粒内容二：质粒DNA的的转化与
12、转化体筛选转化与转化体筛选实验目的实验原理实验仪器、材料、试剂实验步骤 1 2 3 4注意事项思考题 5 6第16页/共28页实实 验验 目目 的的n n 了解转化的概念及其在分子生物学研究中了解转化的概念及其在分子生物学研究中 的意义。的意义。n n 学习将外源质粒学习将外源质粒DNADNA转入受体菌细胞及筛转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。选重组子的方法。第17页/共28页实实 验验 原原 理理 转化：转化：指质粒指质粒DNADNA或以它为载体构建的重组或以它为载体构建的重组DNADNA导入细菌细胞，并使其生物学特性发导入细菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化的过程，是基因工程等研究
13、生可遗传的变化的过程，是基因工程等研究领域的基本实验技术。领域的基本实验技术。第18页/共28页 转化的方法：转化的方法：(1)(1)化学的方法化学的方法(热激法热激法)：使用化学试剂：使用化学试剂(如如CaClCaCl2 2)制备的感受态细胞，通过热激处理将制备的感受态细胞，通过热激处理将载体载体DNADNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；(2)(2)电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNADNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。实实 验验 原原 理理第19页/共28页 用用C
14、aClCaCl2 2处理大肠杆菌细胞使其处于感处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转化进入受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复细菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并在宿主中实现其携带基因的转录、表制并在宿主中实现其携带基因的转录、表达。达。实实 验验 原原 理理第20页/共28页实实 验验 原原 理理第21页/共28页 转化体的筛选方法：转化体的筛选方法：主要用不同抗生素基因筛选。主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：常用的抗生素有：氨苄青霉素氨苄青霉素、卡那霉、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。素、氯霉素、四环素、链霉素等。实实
15、验验 原原 理理第22页/共28页 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。将经过转化后的细胞在选择性抗生素培粒。将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源即带有异源DNADNA分子的受体细胞。分子的受体细胞。实实 验验 原原 理理第23页/共28页 本实验使用的本实验使用的pGEX-4T-2pGEX-4T-2质粒带有氨质粒带有氨苄青霉
16、素抗性基因苄青霉素抗性基因(Amp)(Amp)，理论上只有转，理论上只有转入了质粒的大肠杆菌才能在含入了质粒的大肠杆菌才能在含AmpAmp的培养的培养基生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可基生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培养基上生存（假阳性），因此还需要通过养基上生存（假阳性），因此还需要通过提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。实实 验验 原原 理理第24页/共28页实验仪器、材料、试剂实验仪器、材料、试剂1 1、仪器：、仪器：、仪器：、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热恒温摇床，恒温水浴锅，
17、电热 恒温培养箱，无菌工作台，微恒温培养箱，无菌工作台，微 量移液枪。量移液枪。2 2、材料：、材料：、材料：、材料：DHDH5 5 感受态细胞、质粒感受态细胞、质粒pGEX-4T2pGEX-4T23 3、试剂、试剂、试剂、试剂：LBLB液体及固体培养基、氨苄青霉液体及固体培养基、氨苄青霉 素素AmpAmp（50mg/ml50mg/ml）。）。第25页/共28页实实 验验 步步 骤骤 1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA，同时做一个空白对照（由第一组完成）。转化体系 100ul 1ul空白对照 100ul 1ul 感受态细胞 质粒DNA 蒸馏水第26页/共28页 2 2、轻轻混匀轻轻
18、混匀，立即放在冰上，立即放在冰上30min30min；3 3、4242水浴水浴90s90s，然后迅速冰浴，然后迅速冰浴1-2min1-2min；4 4、加入、加入0.8ml LB0.8ml LB液体培养基，液体培养基，160r/min160r/min，37 37 培养培养 40min 40min；5 5、稀释后，取培养液、稀释后，取培养液100ul100ul，涂布于含有，涂布于含有50ug/ml50ug/ml Amp Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；的平板上，直至液体被培养基全部吸收；6 6、平板倒置，、平板倒置，37 37，过夜培养。，过夜培养。实实 验验 步步 骤骤第27页/共28页