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1、一、实验目的w通过不同细菌（以细菌为代表来说明微生物）通过不同细菌（以细菌为代表来说明微生物）对不同含碳、氮化合物分解利用的情况不同来对不同含碳、氮化合物分解利用的情况不同来了解不同细菌碳、氮代谢类型的多样性。了解不同细菌碳、氮代谢类型的多样性。第1页/共24页二、实验原理二、实验原理 不不同同微微生生物物对对同同种种碳碳、氮氮化化合合物物利利用用情情况况不不同同，而而同同一一微微生生物物对对不不同同碳碳、氮氮化化合合物物分分解解利利用用情情况况也也不不相相同同，反反映映出出微微生生物物具具有有不不同同酶酶系系导导致致代代谢谢类类型型的的差差异异（酶酶系系包包括括胞胞外外酶酶系系及及胞胞内内酶
2、酶系系）。因因此此，不不同同的的微微生生物物具具有有不不同同的的酶酶系系，利利用用不不同同物物质质作作为为底底物物进进行行反反应应后后，产产生生不不同同的的产产物物，在在添添加加适适当当指指示示剂剂的的条条件件下下会会显显示示不不同同的的结结果果，所所以以可可以以利利用用微微生生物物的的不不同同生生理理生生化化反反应应来来作作为为对对微微生生物物分分类类和和鉴鉴定定的的重要依据。重要依据。第2页/共24页糖发酵实验糖发酵实验 细菌在分解糖或醇细菌在分解糖或醇(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘油甘露醇、甘油)的能力有很大的差异。有些细的能力有很大的差异。有些细菌发酵某种糖后
3、产生各种有机酸菌发酵某种糖后产生各种有机酸(如乳酸、醋如乳酸、醋酸、甲酸、琥珀酸酸、甲酸、琥珀酸)及各种气体及各种气体(如氢、甲烷、如氢、甲烷、二氧化碳二氧化碳)。有的细菌只产酸不产气。酸的产。有的细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来指示。在配制培养基时可预生可利用指示剂来指示。在配制培养基时可预先加入溴甲酚紫先加入溴甲酚紫(pH 5(pH 5(黄黄)pH7(pH7(紫紫)。当细。当细菌发酵糖产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。菌发酵糖产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由糖发酵管中倒置的杜氏小管中气体的产生可由糖发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明有无气泡来证明。第3页/共24
4、页第4页/共24页第5页/共24页糖发酵试验第6页/共24页IMViC反应：反应：吲哚实验：吲哚实验：甲基红实验甲基红实验V.P.实验实验柠檬酸盐实验柠檬酸盐实验H2S实验实验第7页/共24页u吲哚试验吲哚试验:检查吲哚的产生检查吲哚的产生 有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。第8页/共24页甲基红试验：检查微生物利用葡萄糖产酸的情况甲基红试验：检查微生物利用葡萄糖产酸的情况 细菌代谢糖产生的有机酸会使培养基变酸，可通过加入的甲基红指示剂（PH6.3 橘黄色-PH4.2 红色）。尽管所用的肠道菌都能发酵葡萄糖产生有机酸
5、，大肠杆菌和产气杆菌在培养早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性PH4.0，而产气杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇，丙酮酸等。第9页/共24页甲基红试验阳性阴性对照第10页/共24页伏伏-普试验：测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中普试验：测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的情况性末端产物的情况 。某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用生成红色的化合物，即V.P.反应阳性。第11页/共24页VP试验阴性阳性大肠杆菌：产气杆菌：+第12
6、页/共24页柠檬酸盐试验：检测柠檬酸盐是否柠檬酸盐试验：检测柠檬酸盐是否被利用被利用有些细菌能够利用柠檬酸盐作为碳源，分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基PH升高，当加入1%的溴麝香草酚兰指示剂(PH 小于6.0 呈黄色，6.0-7.0 绿色，大于7.6 蓝色）时，培养基就会由绿色变为深蓝色。第13页/共24页硫化氢试验：检测硫化氢硫化氢试验：检测硫化氢的产生的产生 有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇到培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。第14页/共24页动力观察：MOTILITYTEST1.Pseudo
7、monasaeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile2.Staphylococcusaureus：Non-motile3.Bacillussubtilis：MotilePrincipleTheloweragarconcentrationinthemediumallowslimitedmovementofmotilebacteriafromtheareaofthestab.Motilitywillbedetectableasdiffusegrowthradiatingfromthestabline.Aspecialdye,atetrazoliumsalt(TTC)maybeaddedto
8、maketheradiatinggrowthmorevisibleasthereddishdiffusearea.第15页/共24页第16页/共24页三、实验器材三、实验器材1.菌种：大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌2.培养基：见表格第17页/共24页四、实验内容四、实验内容试验菌名IMViC糖发酵试验H2S试验吲 哚 试验甲 基红(M.R)试验伏 普（VP）试验柠檬酸盐试验大肠杆菌产气杆菌变形杆菌培养基蛋 白 胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基柠檬酸盐斜面乳糖发酵醋酸铅培养基接种方式液体液体斜面液体穿刺1.1.将大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌在对应培养基内接种将大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌在对应培养基
9、内接种 液体葡葡萄萄糖糖发发酵酵第18页/共24页2.培养培养37 24-48h3.结果观察：结果观察：吲哚试验：1ml乙醚萃取，剧烈摇晃静置分层，沿壁缓加吲哚试剂，观察玫瑰环。M.R试验：加入2滴甲基红试剂，阳性为红色。VP试验:加40KOH约10滴，再加等量5奈酚,酒精灯加热，阳性红色。柠檬酸盐试验：直接观察，阳性蓝色。糖发酵试验：直接观察，产酸黄色;产气，杜氏小管中有气泡。H2S试验：直接观察，阳性有黑色沉淀。第19页/共24页实验名称实验名称培养基培养基菌种菌种现象现象糖发糖发酵实酵实验验葡萄糖发葡萄糖发酵酵葡萄糖发酵培葡萄糖发酵培养基养基大肠、产气大肠、产气颜色变化、有气泡积聚颜色变
10、化、有气泡积聚乳糖发酵乳糖发酵乳糖发酵培养乳糖发酵培养基基大肠、产气大肠、产气IMViC反反应应吲哚实验吲哚实验蛋白胨水培养蛋白胨水培养基基大肠、产气大肠、产气产生红色玫瑰吲哚产生红色玫瑰吲哚甲基红实甲基红实验验葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水培养基水培养基大肠、产气大肠、产气丙酮酸分解为小分子酸，丙酮酸分解为小分子酸，使得培养基颜色变红使得培养基颜色变红V.P实验实验葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水培养基水培养基大肠、产气大肠、产气丙酮酸不分解，氧化后与丙酮酸不分解，氧化后与-萘酚形成红色萘酚形成红色柠檬酸盐柠檬酸盐实验实验柠檬酸盐培养柠檬酸盐培养基基大肠、产气大肠、产气可以利用柠檬酸盐，可以利用柠檬酸
11、盐，pH升升高，颜色变蓝高，颜色变蓝H2S实验实验H2S培养基培养基大肠、变形大肠、变形产生产生PbS黑色沉淀黑色沉淀结果观察结果观察第20页/共24页思考题思考题 1.假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？（P120，2）2.解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨的酶活性的指示剂，而不用丙酮酸?P123，2（2）3.说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用。可以用哪种化合物代替醋酸铅?P123，2（4）第21页/共24页上次实验习题解答上次实验习题解答1 1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养物？请写出实验的主要步骤。、如何确定平板上某单个
12、菌落是否为纯培养物？请写出实验的主要步骤。划单菌落培养，看长出的单菌落是否均一随机挑取几个单菌落进行革兰氏染色，看染色结果是否一致；随机挑取几个单菌落进行生化鉴定，看反应结果是否一致。如果上述结果一致，则说明平板上单个菌落是为纯培养物，只要某一处出现不一致，则不是纯培养物。第22页/共24页2 2、如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如、如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明实验方案。何完成？请写出简明实验方案。配制酪素平板；接种适当的稀释液；筛选产透明圈的细菌；接种液体培养基培养；取培养液上清（含细菌分泌的蛋白酶），检测其在高温下蛋白酶是否有活力。第23页/共24页感谢您的观看！第24页/共24页