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1、实验九微生物的生理生化反应一、实验目的一、实验目的w通过不同细菌（以细菌为代表来说明微生物）通过不同细菌（以细菌为代表来说明微生物）对不同含碳、氮化合物分解利用的情况不同来对不同含碳、氮化合物分解利用的情况不同来了解不同细菌碳、氮代谢类型的多样性。了解不同细菌碳、氮代谢类型的多样性。糖糖发发酵酵试试验验IMViC反应：反应：吲哚实验：吲哚实验：甲基红实验甲基红实验V.P.实验实验柠檬酸盐实验柠檬酸盐实验H2S实验实验u吲哚试验吲哚试验:检查吲哚的产生检查吲哚的产生 有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。甲基红试验：检查微
2、生物利用葡萄糖产酸的情况甲基红试验：检查微生物利用葡萄糖产酸的情况 细菌代谢糖产生的有机酸会使培养基变酸，可通过加入的甲基红指示剂（PH6.3 橘黄色-PH4.2 红色）。尽管所用的肠道菌都能发酵葡萄糖产生有机酸，大肠杆菌和产气杆菌在培养早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性PH4.0，而产气杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇，丙酮酸等。甲甲基基红红试试验验阳性阳性阴性阴性对照对照伏伏-普试验：测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中普试验：测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的情况性末端产物的情况 。某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生
3、成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用生成红色的化合物，即V.P.反应阳性。VP试试验验阴性阴性阳性阳性大肠杆菌：大肠杆菌：产气杆菌：产气杆菌：+柠檬酸盐试验：检测柠檬酸盐是否被柠檬酸盐试验：检测柠檬酸盐是否被利用利用有些细菌能够利用柠檬酸盐作为碳源，分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基PH升高，当加入1%的溴麝香草酚兰指示剂(PH 小于6.0 呈黄色，6.0-7.0 绿色，大于7.6 蓝色）时，培养基就会由绿色变为深蓝色。硫化氢试验：检测硫化氢硫化氢试验：检测硫化氢的产生的产生 有些细菌能分解含硫的有机物，如
4、胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇到培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。动力观察：动力观察：MOTILITYTEST1.Pseudomonasaeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile2.Staphylococcusaureus：Non-motile3.Bacillussubtilis：MotilePrincipleTheloweragarconcentrationinthemediumallowslimitedmovementofmotilebacteriafromtheareaofthestab.Motilitywillbedetectable
5、asdiffusegrowthradiatingfromthestabline.Aspecialdye,atetrazoliumsalt(TTC)maybeaddedtomaketheradiatinggrowthmorevisibleasthereddishdiffusearea.三、实验器材三、实验器材1.菌种：大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌2.培养基：见表格四、实验内容四、实验内容试验试验菌名菌名IMViC糖发酵糖发酵试验试验H2S试验试验吲吲 哚哚 试试验验甲甲 基基红红(M.R)试验试验伏伏 普普（VP）试试验验柠檬酸柠檬酸盐试验盐试验大肠杆菌大肠杆菌产气杆菌产气杆菌变形杆菌变形杆菌培
6、养基培养基蛋蛋 白白 胨胨水水培养基培养基葡葡萄萄糖糖蛋蛋白白胨胨水水培养基培养基柠檬酸柠檬酸盐斜面盐斜面乳糖乳糖发酵发酵醋酸铅醋酸铅培养基培养基接种方式接种方式液体液体液体液体斜面斜面液体液体穿刺穿刺1.1.将大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌在对应培养基内接种将大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌在对应培养基内接种 液体液体葡葡萄萄糖糖发发酵酵2.培养培养37 24-48h3.结果观察：结果观察：吲哚试验：1ml乙醚萃取，剧烈摇晃静置分层，沿壁缓加吲哚试剂，观察玫瑰环。M.R试验：加入2滴甲基红试剂，阳性为红色。VP试验:加40KOH约10滴，再加等量5奈酚,酒精灯加热，阳性红色。柠檬酸盐试验：直接观察
7、，阳性蓝色。糖发酵试验：直接观察，产酸黄色;产气，杜氏小管中有气泡。H2S试验：直接观察，阳性有黑色沉淀。实验名称实验名称培养基培养基菌种菌种现象现象糖发糖发酵实酵实验验葡萄糖发葡萄糖发酵酵葡萄糖发酵培葡萄糖发酵培养基养基大肠、产气大肠、产气颜色变化、有气泡积聚颜色变化、有气泡积聚乳糖发酵乳糖发酵乳糖发酵培养乳糖发酵培养基基大肠、产气大肠、产气IMViC反反应应吲哚实验吲哚实验蛋白胨水培养蛋白胨水培养基基大肠、产气大肠、产气产生红色玫瑰吲哚产生红色玫瑰吲哚甲基红实甲基红实验验葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水培养基水培养基大肠、产气大肠、产气丙酮酸分解为小分子酸，丙酮酸分解为小分子酸，使得培养基颜色变
8、红使得培养基颜色变红V.P实验实验葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水培养基水培养基大肠、产气大肠、产气丙酮酸不分解，氧化后与丙酮酸不分解，氧化后与-萘酚形成红色萘酚形成红色柠檬酸盐柠檬酸盐实验实验柠檬酸盐培养柠檬酸盐培养基基大肠、产气大肠、产气可以利用柠檬酸盐，可以利用柠檬酸盐，pH升升高，颜色变蓝高，颜色变蓝H2S实验实验H2S培养基培养基大肠、变形大肠、变形产生产生PbS黑色沉淀黑色沉淀结果观察结果观察思考题思考题 1.假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？（P120，2）2.解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨的酶活性的指示剂，而不用丙
9、酮酸?P123，2（2）3.说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用。可以用哪种化合物代替醋酸铅?P123，2（4）上次实验习题解答上次实验习题解答1 1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养物？请写出实验的主要步骤。培养物？请写出实验的主要步骤。划单菌落培养，看长出的单菌落是否均一随机挑取几个单菌落进行革兰氏染色，看染色结果是否一致；随机挑取几个单菌落进行生化鉴定，看反应结果是否一致。如果上述结果一致，则说明平板上单个菌落是为纯培养物，只要某一处出现不一致，则不是纯培养物。2 2、如果一项科学研究内容需从自然界中筛、如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明实验方案。成？请写出简明实验方案。配制酪素平板；接种适当的稀释液；筛选产透明圈的细菌；接种液体培养基培养；取培养液上清（含细菌分泌的蛋白酶），检测其在高温下蛋白酶是否有活力。