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1、实验实验1.1.大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的培养与的培养与分离分离第一页，共二十一页。微生物微生物病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌(zhnjn)(zhnjn)原生生物原生生物原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞非细胞非细胞(xbo)(xbo)结构结构特点：特点：结构结构简单简单,形体形体微小微小.通常要用通常要用光学显微镜或电子显微光学显微镜或电子显微镜镜才能才能(cinng)(cinng)看到，有的甚至没有细胞结构看到，有的甚至没有细胞结构.一、基础知识一、基础知识:1.1.微生物的种类微生物的种类:第二页，共二十一页。2023/2/32苍南中学 许允文
2、关于大肠杆菌关于大肠杆菌:革兰氏染色革兰氏染色(rns)(rns)：代谢类型：代谢类型：主要分布：主要分布：危害：危害：应用：应用：革兰氏阴性菌（不着色革兰氏阴性菌（不着色(zhus)）异养兼性厌氧型异养兼性厌氧型肠道肠道一般一般(ybn)无害，少数有害无害，少数有害是基因工程中的主要受体菌之一是基因工程中的主要受体菌之一2核糖体核糖体 1阅读阅读P18-19第三页，共二十一页。2023/2/33苍南中学 许允文2.2.微生物的培养微生物的培养(piyng)(piyng):1)1)培养基的营养成分培养基的营养成分:2)2)培养基的种类培养基的种类(zhngli)(zhngli):碳源碳源 氮源
3、氮源 水分水分(shufn)(shufn)无机盐无机盐 生长生长因子因子按物理性质分按物理性质分液体培养基液体培养基:扩大培养扩大培养固体培养基固体培养基:分离、鉴定、纯化分离、鉴定、纯化按功能分按功能分普通培养基：普通培养基：选择培养基：筛选选择培养基：筛选鉴别培养基：鉴定鉴别培养基：鉴定含氨卞青霉素的培养基含氨卞青霉素的培养基伊红伊红美蓝培养基美蓝培养基第四页，共二十一页。2023/2/34苍南中学 许允文3.3.细菌的分离细菌的分离:原理原理:不同的细胞具有不同的菌落特征不同的细胞具有不同的菌落特征(tzhng)(tzhng);有些微生物对抗生素、高盐等具有抗性的有些微生物对抗生素、高盐
4、等具有抗性的特点。特点。方法方法:划线法、涂布法划线法、涂布法 选择培养基培养选择培养基培养第五页，共二十一页。2023/2/35苍南中学(zhngxu)许允文二、大肠杆菌二、大肠杆菌(dchnnjn)的培养与分离的培养与分离实验目的实验目的:1 1、进行、进行(jnxng)(jnxng)大肠杆菌的大肠杆菌的扩增扩增，利用，利用_培培养基养基进行细菌培养操作。进行细菌培养操作。2 2、进行大肠杆菌的、进行大肠杆菌的分离分离，利用，利用_培养基培养基进行细菌的进行细菌的划线培养划线培养。3 3、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。理。液体液体(yt)固体
5、固体第六页，共二十一页。2023/2/36苍南中学 许允文一、配制培养基，调整一、配制培养基，调整pHpH并灭菌并灭菌(mi jn)(mi jn)，倒平板备用。，倒平板备用。按一定营养比例配制培养基按一定营养比例配制培养基+琼脂，融化琼脂，融化调整调整pH pH 灭菌灭菌(mi jn)(mi jn)倒平板、搁斜面倒平板、搁斜面细菌细菌(xjn)(xjn):中性偏碱中性偏碱霉菌霉菌:中性偏酸中性偏酸1、放走冷空气；、放走冷空气；2、灭菌锅压力与大气压相、灭菌锅压力与大气压相同时才能打开。同时才能打开。第七页，共二十一页。2023/2/37苍南中学 许允文倒平板、搁置倒平板、搁置(gzh)斜面斜面
6、待培养基冷却到待培养基冷却到50 50 左右时，在酒精灯附近左右时，在酒精灯附近(fjn)(fjn)倒平板。倒平板。凝固凝固(nngg)后，倒置放后，倒置放置置思考：如何鉴定灭菌是否思考：如何鉴定灭菌是否彻底？彻底？放入培养箱中，放入培养箱中，2d后观察后观察平板是否有菌落生成平板是否有菌落生成第八页，共二十一页。2023/2/38苍南中学 许允文二、接种、扩大二、接种、扩大(kud)培养培养1、扩大培养所、扩大培养所用的培养基是？用的培养基是？2、接种的场所、接种的场所是？是？3、为何、为何(wih)要等要等接种环冷却后，再接种环冷却后，再取菌体？取菌体？第九页，共二十一页。2023/2/3
7、9苍南中学(zhngxu)许允文三、划线三、划线(huxin)分离分离1、第、第2、3、4级划线前是否级划线前是否(shfu)都要对接种环进行灭菌？都要对接种环进行灭菌？2、下级划线开始于上一级划线的起始端还是末端？、下级划线开始于上一级划线的起始端还是末端？第十页，共二十一页。2023/2/310苍南中学(zhngxu)许允文第十一页，共二十一页。2023/2/311苍南中学(zhngxu)许允文四、培养四、培养(piyng)(piyng)将接种后的培养皿放入恒温箱内，将接种后的培养皿放入恒温箱内，在在3737下倒置培养下倒置培养12-24h12-24h。平板平板(pngbn)稀释涂布法稀释
8、涂布法平板平板(pngbn)划线法划线法第十二页，共二十一页。2023/2/312苍南中学 许允文平板划线分离法平板划线分离法用途：一般多用于从菌种的纯化；用途：一般多用于从菌种的纯化；优点：可以观察菌落特征，对混合优点：可以观察菌落特征，对混合(hnh)菌进行分离；菌进行分离；缺点：不能计数缺点：不能计数稀释涂布平板法稀释涂布平板法用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。回收率计数。优点：可以计数，可以观察菌落特征。优点：可以计数，可以观察菌落特征。缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干
9、燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。第十三页，共二十一页。2023/2/313苍南中学(zhngxu)许允文五、纯化五、纯化(chn hu)(chn hu)(chn hu)(chn hu)与保存与保存 1 1、如何进一步纯、如何进一步纯化化(chn hu)(chn hu)菌种？菌种？2 2、如何保存菌、如何保存菌种？种？第十四页，共二十一页。2023/2/314苍南中学(zhngxu)许允文 1.1.培养基灭菌后，需要冷却培养基灭菌后，需要冷却(lngqu)(lngqu)到到50 50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培
10、左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉形瓶，感觉(gnju)(gnju)锥形瓶的温度下降到刚刚不锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。烫手时，就可以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。生物污染培养基。第十五页，共二十一页。2023/2/315苍南中学 许允文3.3.平板平板(pngbn)(pngbn)冷凝后，为什么要将平板冷凝后，为什么要将平板(pngb
11、n)(pngbn)倒倒置？置？4.4.在倒平板在倒平板(pngbn)(pngbn)的过程中，如果不小心将培养基的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿壁的部位，这个平板溅在皿盖与皿壁的部位，这个平板(pngbn)(pngbn)还能用来还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答：可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成答：可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成(zo(zo chn)chn)菌落的细菌随水而扩散，得不到单细胞菌落；防止菌落的细菌随水而扩散，得不到单细胞菌落；防止杂菌污染。杂菌污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿壁的培答：空气中的微生物可能在皿盖与皿壁的培养基上滋生而造成污染
12、，因此最好不要用这个平板养基上滋生而造成污染，因此最好不要用这个平板培养微生物。培养微生物。第十六页，共二十一页。2023/2/316苍南中学 许允文5.5.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染如何操作才可以尽量避免被杂菌污染(wrn)(wrn)？6.6.在培养后如何判断是否有杂菌污染？在培养后如何判断是否有杂菌污染？7.7.实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？操作快捷操作快捷,减少操作时间减少操作时间;灭菌要彻底灭菌要彻底,降低环境污染几降低环境污染几率率;注意注意(zh y)(zh y)微生物生长条件微生物生长条件,如如pHpH、渗透压、温度等。、渗
13、透压、温度等。是否有不同形态是否有不同形态(xngti)(xngti)的菌落；用显微镜镜检细胞、的菌落；用显微镜镜检细胞、孢子、芽孢等形态孢子、芽孢等形态(xngti)(xngti)。高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌第十七页，共二十一页。2023/2/317苍南中学 许允文8 8、转基因用的质粒通常加入了如抗氨苄青霉、转基因用的质粒通常加入了如抗氨苄青霉素基因。转基因质粒转化进入大肠杆菌后，素基因。转基因质粒转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉素基因的杂菌与不能生长。
14、如何分离转基因素基因的杂菌与不能生长。如何分离转基因工程菌，并保证不被普通工程菌，并保证不被普通(ptng)(ptng)的大肠杆菌污的大肠杆菌污染？染？将菌种接种将菌种接种(jizhng)在含氨苄青霉素的培养基在含氨苄青霉素的培养基中培养。中培养。第十八页，共二十一页。2023/2/318苍南中学(zhngxu)许允文1 1、高压、高压(goy)(goy)蒸气灭菌蒸气灭菌2 2、灼烧灭菌、灼烧灭菌3 3、紫外线灭菌、紫外线灭菌4 4、过滤（去除杂菌）、过滤（去除杂菌）思考：灭菌与消毒有何区别？思考：灭菌与消毒有何区别？灭菌灭菌(mi jn)的方法：的方法：消毒：消毒：利用化学或物理利用化学或物
15、理(wl)(wl)方法，杀死大部份致病微生方法，杀死大部份致病微生物的过程。物的过程。灭菌灭菌:以化学剂或物理方法消灭以化学剂或物理方法消灭所有所有微生物，包括所有细菌微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌完全无菌之过程。之过程。第十九页，共二十一页。2023/2/319苍南中学 许允文菌落菌落单个或少数细菌单个或少数细菌(xjn)在固体培养基在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体具有一定形态结构的子细胞群体。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。第二十页，共二十一页。2023/2/320苍南中学(zhngxu)许允文内容(nirng)总结实验1.大肠杆菌的培养与分离。特点：结构简单,形体微小.通常要用光学(gungxu)显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.。2/28/2022。苍南中学 许允文。碳源 氮源 水分 无机盐 生长因子。伊红美蓝培养基。划线法、涂布法。1、进行大肠杆菌的扩增，利用_培养基进行细菌培养操作。3、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。2、下级划线开始于上一级划线的起始端还是末端。20第二十一页，共二十一页。