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1、分析化学荧光第1页，本讲稿共36页11.1概概述述荧光：荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。低振动能级返回基态时发射出的光。荧光分析法：荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。物质鉴定和含量测定的方法。荧光分析法的优点荧光分析法的优点：灵敏度高、选择性好灵敏度高、选择性好第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级分子荧光分析法分子荧光分析法（molecularfluorometry）第2页，本讲稿共36页自旋量子数自旋量子数s=1
2、/2或或-1/2总自旋量子数总自旋量子数S0多重性多重性 2S1111.2基本原理基本原理基态基态单重态单重态激发激发单重态单重态激发激发三重态三重态第3页，本讲稿共36页荧光和磷光产生示意图荧光和磷光产生示意图吸收吸收振动振动驰豫驰豫内部能量转内部能量转换换荧光发射荧光发射体系间体系间跨越跨越磷光发射磷光发射第4页，本讲稿共36页振动驰豫振动驰豫内部能量转换内部能量转换处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的
3、过程。态的最低振动能级的过程。当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。无辐射跃迁无辐射跃迁第5页，本讲稿共36页关于荧光关于荧光荧光的产生需经历两个过程：荧光的产生需经历两个过程：吸收吸收发射发射第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级振动驰豫振动驰豫内部能量转换内部能量转换第6页，本讲稿共36页 例例 题题1.所所谓谓荧荧光光，即即某某些些物物质质经经入入射射光光照照射射后后，吸吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射
4、光：收了入射光的能量，从而辐射出比入射光：A波长长的光线波长长的光线 B波长短的光线波长短的光线 C能量大的光线能量大的光线 D频率高的光线频率高的光线第7页，本讲稿共36页11.2.2激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱1.激发光谱：激发光谱：excitationspectrum荧光光谱荧光光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。长荧光的相对效率。2.发射光谱：发射光谱：fluorescence/emissionspectrumF exF-em表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。
5、第8页，本讲稿共36页荧光光谱的特征荧光光谱的特征（1）斯托克斯位移（）斯托克斯位移（Stokesshift）：）：emex产生原因：产生原因：能量损失能量损失（1）内转换和振动驰豫）内转换和振动驰豫（2）激发态分子返回基态不同振）激发态分子返回基态不同振动能级动能级（3）激发态分子与溶剂分子的）激发态分子与溶剂分子的相互作用相互作用第9页，本讲稿共36页荧光光谱的特征荧光光谱的特征（2）荧光光谱的形状与激发波长无关）荧光光谱的形状与激发波长无关产生原因：产生原因：荧光发射是从特定的激发态返回基态荧光发射是从特定的激发态返回基态荧光光谱的强度与激发波长有关荧光光谱的强度与激发波长有关第10页，
6、本讲稿共36页荧光光谱的特征荧光光谱的特征（3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系）荧光光谱与激发光谱的镜像关系产生原因：产生原因：电子基态的振动能级分布与电子基态的振动能级分布与激发态的相似激发态的相似第11页，本讲稿共36页 例例 题题下列说法哪个是错误的？下列说法哪个是错误的？A荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关B荧光波长总是大于激发光波长荧光波长总是大于激发光波长C荧荧光光光光谱谱的的最最短短波波长长和和激激发发光光谱谱的的最最长长波波长长相相对应对应D最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应第12页，本讲稿共36页 11.2.3分子
7、结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：1.强的紫外可见吸收强的紫外可见吸收2.一定的荧光效率一定的荧光效率第13页，本讲稿共36页 荧光效率（荧光量子产率）荧光效率（荧光量子产率）1.荧光效率荧光效率 f01第14页，本讲稿共36页 2.分子结构对荧光效率的影响分子结构对荧光效率的影响分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：1.强的紫外可见吸收强的紫外可见吸收2.一定的荧光效率一定的荧光效率长共轭结构长共轭结构分子的刚性和共平面性分子的刚性和共平面性取代基作用取代基作用第15页，本讲稿共36页ex 205nm 286
8、nm 356nmem 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.36 （1）长共轭结构）长共轭结构结论：结论：电子共轭程度越大，荧光强度（荧光电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，荧光波长长移效率）越大，荧光波长长移第16页，本讲稿共36页联苯联苯f 0.2 芴芴f 1.0（2）分子的刚性和共平面性）分子的刚性和共平面性第17页，本讲稿共36页结论：结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移越强，荧光效率越大，荧光波长长移2、分子的刚性和共平面性、分子的刚性和共平面性第18页，本讲稿共3
9、6页（3）取代基作用）取代基作用给电子基团给电子基团吸电子基团吸电子基团与电子体系相互作用较小的取代基与电子体系相互作用较小的取代基NH2、OH、OCH3、NHR、NR2荧光效荧光效率提高、荧光波长长移率提高、荧光波长长移COOH、NO2、CO、NO、卤素、卤素荧光效率减弱甚至熄灭荧光效率减弱甚至熄灭第19页，本讲稿共36页 例例 题题关于荧光效率，下面错误的叙述是：关于荧光效率，下面错误的叙述是：A具有长共轭的具有长共轭的*跃迁的物质具有较大的荧光效跃迁的物质具有较大的荧光效率率B分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大C顺式异构体的荧光效率大于反式异构体
10、顺式异构体的荧光效率大于反式异构体D共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响也共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响也不同不同 第20页，本讲稿共36页11.2.4影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素温度温度溶剂溶剂pH荧光熄灭荧光熄灭散射光散射光学习目的学习目的:提高荧光分析的灵敏度和选择性提高荧光分析的灵敏度和选择性第21页，本讲稿共36页1.温度温度荧光素钠的乙醇溶液在下列哪种条件下荧光强度最强？荧光素钠的乙醇溶液在下列哪种条件下荧光强度最强？A0B-100C-200D-300 1.一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物质的荧一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物质的荧光效
11、率和荧光强度将降低。光效率和荧光强度将降低。2.原因原因:温度升高时温度升高时，分子运动速度加快分子运动速度加快，分子间碰撞，分子间碰撞几率增加，几率增加，使无辐射跃迁增加使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光效从而降低了荧光效率率第22页，本讲稿共36页2.溶剂溶剂萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？A1氯丙烷氯丙烷B1溴丙烷溴丙烷C1碘丙烷碘丙烷D1，2二氯丙烷二氯丙烷1.一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强。荧光强度也增强。2.原因原因:在极性溶剂中，在极性溶剂中，的能量差小的能量差小 第23
12、页，本讲稿共36页3.pH的影响的影响苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？ApH1BpH3CpH13DpH10 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同酸度中分荧光强度有较大影响，主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡的改变。子和离子间的平衡的改变。第24页，本讲稿共36页4.荧光熄灭的影响荧光熄灭的影响荧光熄灭，又称荧光猝灭，是指荧光物质分子荧光熄灭，又称荧光猝灭，是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用而引起荧光强度与溶剂分子或溶质分子的相互作用而引起荧光强度降低或荧光强
13、度与浓度偏离线性关系的现象降低或荧光强度与浓度偏离线性关系的现象（1）选择合适的溶剂）选择合适的溶剂（2）溶液浓度在合适的范围）溶液浓度在合适的范围第25页，本讲稿共36页5.散射光的干扰散射光的干扰散射光散射光选择适当的激发波长消除拉曼光的选择适当的激发波长消除拉曼光的干扰干扰瑞利光瑞利光拉曼光拉曼光第26页，本讲稿共36页第27页，本讲稿共36页11.3定量分析方法定量分析方法Quantitativeanalysisoffluorometry第28页，本讲稿共36页11.3.1荧光强度与荧光物质浓度的关系荧光强度与荧光物质浓度的关系1.观测方向观测方向:与激发光源垂直与激发光源垂直2.原因
14、原因:消除透射光的影响消除透射光的影响第29页，本讲稿共36页关于灵敏度的问题关于灵敏度的问题紫外可见紫外可见:10-5荧光荧光:10-7第30页，本讲稿共36页csFsF0FxF0cx11.3.2定量分析方法定量分析方法1、标准曲线法、标准曲线法第31页，本讲稿共36页11.3.2定量分析方法定量分析方法2、比例法（对照法）、比例法（对照法）第32页，本讲稿共36页 例例 题题在在测测量量分分子子荧荧光光强强度度时时，要要在在与与入入射射光光成成直直角角的的方方向上进行测量，这是由于：向上进行测量，这是由于：A荧荧光光是是向向各各个个方方向向发发射射的的，为为了了减减小小透透射射光光的的影影
15、响响B只有在与入射光成直角的方向上，才有荧光只有在与入射光成直角的方向上，才有荧光C荧光强度比透射光强度小荧光强度比透射光强度小 D荧光的波长比入射光波长长荧光的波长比入射光波长长第33页，本讲稿共36页11.4荧光分析技术及应用荧光分析技术及应用光源光源激发单色器激发单色器样品池样品池发发 射射单色器单色器检测器检测器第34页，本讲稿共36页 1.光源光源2.单色器：单色器：3.样品池：样品池：4.检测器：检测器：荧光分光光度计的主要部件荧光分光光度计的主要部件氙灯：氙灯：波长范围波长范围250700nm，300400nm谱线强度几谱线强度几乎相等乎相等光电倍增管光电倍增管激发单色器、发射单色器激发单色器、发射单色器石英、四面透光石英、四面透光第35页，本讲稿共36页3、作用、作用1、荧光试剂（荧光探针）、荧光试剂（荧光探针）2、化学物质、化学物质（1）提高测定的灵敏度和选择性）提高测定的灵敏度和选择性（2）扩大荧光分析法的应用范围）扩大荧光分析法的应用范围11.4.2应用与示例应用与示例（1）荧光胺）荧光胺（2）邻苯二甲醛）邻苯二甲醛（3）丹酰氯）丹酰氯第36页，本讲稿共36页