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1、微生物限度检查方法和验证微生物限度检查方法和验证第1页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply内容介绍内容介绍1.法规对微生物限度检查法验证的要求；2.微生物的基本知识；3.微生物限度检查法的验证；4.消除供试液抑菌性的方法；第2页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply一、法规对微生物限度法验证的要求第3页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12
2、Global Manufacturing and Supply新版新版GMP（欧盟GMP和ICHQ7A）：12.8 分析方法验证：分析方法验证：12.80 分析方法应经过验证，除非采用的方法是相关的药典或其他法规中收载的方法。然而所有测试方法的适应性应当在实际使用条件下确认，并应有文件记录。12.82 应在分析仪器/设备完成确认后，再着手分析方法的验证。12.83 对已验证分析方法的任何修改均应有完整的记录，这类记录应包括修改的理由和充分的数据，以证实经修改的方法与规定的方法同样准确、可靠。第4页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global M
3、anufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：1)前言；2)检验量；3)供试液制备；4)计数实验的培养基适用性；5)计数实验的方法验证；6)计数实验的操作方法；7)控制菌检查的培养基适用性；第5页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：8)控制菌检查的方法验证；9)控制菌检查的内容；10)标准体系。第6页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2
4、010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：1)前言：前言中修订了控制菌检查的温度，规定与细菌计数实验温度相同，均为3035；（3537 3035）前言中增订了对于特殊品种可以最小包装单位报告的规定。2）检验量：检验量中对要求进行沙门菌检查的供试品，其检验量应增加20g或20ml的规定。第7页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：3）供试液制
5、备：增订了贴剂供试品的制备方法；修订了离心沉淀法，删除了高速离心的规定，并对该方法的使用范围进行了限定。10版：取一定量的供试液，500rpm离心3分钟，取全部上清夜混合。用于细菌检查。05版：取一定量的供试液，3000rpm离心20分钟，弃去上清夜，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。第8页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：4）计数实验的培养基适用性：该部分内容均为新增；规定了该内容的应用范围：细菌、霉菌和酵母菌计数用的
6、培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配置的培养基均应检查。采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法。标准菌种为：大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；第9页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：4）计数实验的培养基适用性：枯草芽孢杆菌；白色念珠菌；黑曲霉。规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限：菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8,可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8，
7、在验证过的储存期内使用。引入了对照培养基的概念；第10页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：4）计数实验的培养基适用性：结果判定：若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判定培养基的适用性检查符合规定。5）计数实验的方法验证：增订了常见干扰物的中和剂或灭活方法的参考表格；第11页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Glo
8、bal Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：5）计数实验的方法验证：对采用多种方法仍无法得到满意验证结果的情况，提供了两种方法：允许使用更高稀释级的供试液进行方法验证，若验证符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级供试液进行供试品检验；允许选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。第12页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：6）计数实验的操作
9、方法：平皿法删除了应取23个连续适宜稀释级供试液进行检验的规定；细菌培养时间：由48小时 3天；霉菌、酵母菌培养时间：由72小时 5天必要时延长培养时间：由57天 7天。菌数报告规则进行了修订：计数不再设置下限；以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告供试品中所含的菌数。第13页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：6）计数实验的操作方法：薄膜过滤法滤膜直径调整为约50mm，并规定若采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整；总冲洗
10、量规定不得超过1000ml。第14页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：7）控制菌检查的培养基适用性：该部分内容均为新增；规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目；控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配置的培养基均应检查。第15页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典
11、10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：7）控制菌检查的培养基适用性：采用标准菌种比较的判定方法，标准菌种包括；大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；乙型副伤寒沙门菌；铜绿假单胞菌；生孢梭菌；白色念珠菌。第16页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：7）控制菌检查的培养基适用性：根据培养基的用途不同，适用性检查项目包括：增菌培养基的促生长能力；固体培养基的促生长能力；培养基的抑制能力；固体培养基的指示能力；液体培养基的指示能力。所谓促生
12、长能力指试验菌于被检培养基，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养，同对照培养基管比较，该控制菌应生长良好。第17页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：7）控制菌检查的培养基适用性：所谓抑制能力指试验菌于被检培养基，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。所谓指示能力指试验菌于被检培养基，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应等应同
13、对照培养基一致。第18页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：8）控制菌检查的方法验证：删除了阴性菌对照组的概念。9）控制菌检查的内容：大肠菌群的培养基进行了修订，现改用乳糖胆盐发酵培养基，05版为胆盐乳糖发酵培养基。梭菌的增菌培养基修订为梭菌增菌培养基，删除了庖肉培养基。增订了白色念珠菌检查法，并增订了与之相关的培养基。第19页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Man
14、ufacturing and Supply中国药典中国药典10版同版同05版的主要差别：版的主要差别：10）标准体系：菌落计数单位从“个”修订为“cfu”；阴道、尿道给药制剂增订了白色念珠菌控制要求；直肠给药制剂删除了大肠埃希菌的控制要求。第20页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply二、微生物的基本知识二、微生物的基本知识第21页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply什么是微生物？什
15、么是微生物？微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不见的微小生物的总称。包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌（过去称蓝藻或蓝绿藻），属于真核类的真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等。第22页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物特点：1.种类多、分布广;迄今为止，我们知道的微生物约有10万种，目前已知的种类只占地球上实际存在的微生物总数的20%。2.个体小、面积大;物体的表面积和体积之
16、比称为比表面积，大肠杆菌的比表面积是人的30万倍。第23页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply3.吸收多、转化快;如大肠杆菌在合适条件下，每小时可以消耗相当于自身重量2000倍的糖，而人体则需要40年之久。4.适应强、易变异。微生物特点（续）：第24页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply三、微生物限度检查三、微生物限度检查方法的验证方法的验证第25页，本讲稿共75页Reported
17、 by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply 微生物限度实验室的要求：CP2010要求微生物限度检查的环境需要满足，标准为GBT1629X-1996。悬浮粒子的要求：第26页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物限度实验室的要求：浮游菌和沉降菌：试验区域的悬浮粒子、浮游菌和沉降菌应符合接受标准，检测区域的环境同生产区一致。第27页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Glo
18、bal Manufacturing and Supply方法验证的必要性：环境保证环境保证培养基保证培养基保证无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查有效的方法有效的方法方法验证方法验证SOP操作操作有效的结果有效的结果可靠的结论可靠的结论结果判断结果判断第28页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply方法验证的流程：需前处理需前处理不需前处理不需前处理有抑菌作用有抑菌作用无抑菌作用无抑菌作用样品样品检查检查去除抑菌作用去除抑菌作用验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。验证前处理方法对污染
19、菌生长、检出的影响。验证抑菌活性去除的有验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。染菌生长、检出的影响。可以通过验可以通过验证实验判断证实验判断第29页，本讲稿共75页验证什么？验证什么？1.前处理；2.去除抑菌作用；3.用到的一切。Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply第30页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply 在验证时，应对每一试验菌逐一验证。通常微
20、生物限度检查法验证包括：1.细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证 定量回收率测定实验 2.控制菌检查方法的验证。定性能否生长、专属性实验第31页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物限度检查方法微生物限度检查方法：通常微生物限度检查有两种方法即：1.平皿法2.薄膜过滤法。两种方法的优缺点：平皿法：若样品本身的混浊，会干扰计数结果；由于接种量限制，试验灵敏度受局限；操作简便，设备要求低。第32页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global
21、Manufacturing and Supply微生物限度检查方法微生物限度检查方法：两种方法的优缺点薄膜过滤法：操作复杂，设备要求高；不适用于无法溶解的样品；大体积检验量，检验灵敏度不受局限；样品中的抑菌因素可被滤除；中和试剂可应用在淋洗液中，如：-内酰胺酶；分散剂可作为溶剂，如十四烷酸异丙酯。第33页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵
22、母菌数的测定。1供试液的制备：通常供试液的制备分为：1.1 液体供试品；1.2 固体、半固体或粘稠性供试品；第34页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：1供试液的制备：1.3 需用特殊方法制备供试液的供试品：1.3.1 非水溶性供试品；1.3.2 膜剂供试品；1.3.3 肠溶及结肠溶制剂供试品；1.3.4 气雾剂、喷雾剂供试品；1.3.5 贴剂供试品；第35页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global M
23、anufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：1供试液的制备：1.4 具有抑菌活性的供试品：通常采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性。1.4.1 培养基稀释法；取规定量的供试液至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌和酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每毫升供试液可等量分注多个平皿培养计数。每毫升供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为1ml的菌落数。控制菌检查时可加大培养基的用量。第36页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturin
24、g and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：1供试液的制备：1.4 具有抑菌活性的供试品：1.4.2 离心沉淀法；取一定量的供试液，500rpm离心3分钟，取全部上清夜混合。该方法仅适用于细菌计数或控制菌（细菌）检查。该方法只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小等直接影响着样品中微生物的回收，易造成检验结果不能真实反应供试品的污染情况。因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不易采用高速离心沉降集菌。第37页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing
25、and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：1供试液的制备：1.4 具有抑菌活性的供试品：1.4.2 离心沉淀法；例如：小儿惊风散。本法操作较烦琐，药品中污染的微生物有一定的损失。1.4.3 薄膜过滤法；通常薄膜孔径应不大于0.45um，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。滤器和滤膜在使用前采用适宜的方法进行灭菌。使用第38页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：1供试液的制备：1.4 具有抑菌活性的供试品：时应保证滤膜
26、的在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试液其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。供试液经过滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml.例如：葡萄糖酸洗必泰含漱剂、氯霉素滴眼等。注意：供试液应加入较多量的稀释液稀释后，再注入滤器中第39页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：1供试液的制备：1.4 具有抑菌活性的供试品：1.4.4 中和法；常用的中和剂或灭活方法如下：第40
27、页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：第41页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：1.4.4 中和法；例如：磺胺类可加对氨基苯甲酸（100ml增菌培养基中含1%对氨基苯甲酸0.5-1.0ml）如：复方新诺明片。含重金属盐类可用含巯基化合物（硫乙醇酸钠，L-胱氨酸）的培养基作增菌培养液。如：磺胺嘧啶银软膏-金黄色葡萄球菌
28、与绿脓杆菌的检验。脂溶性药物用表面活性剂中和。如：复方痔疮栓（含洗必泰）中的绿脓杆菌的检验，仅用吐温-80制备供试液即可。第42页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：1.4.5 联合使用；适用于抑菌作用较强的中西药制剂。如：复方洗必泰栓（水溶性基质）金黄色葡萄球菌的检验用1%吐温-80稀释液制备供试液膜法过滤滤膜置含5%吐温-80的硫乙醇酸盐增菌液中（+）；生白安片（含盐酸小檗胺）大肠杆菌检验低速离心薄膜过滤法（+）。第43页，本讲稿共75页Reporte
29、d by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：在确定中和剂是否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。综上，对于具有抑菌活性的供试品，为了消除供试品的抑菌性应尽量选择操作简便、快速的方法，同时所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌活性比较强的供试品，在供试品溶液形状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法。第44页，本讲稿共
30、75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：详细的供试液的制备参见 中国药典附录XI J 附录107页 微生物限度检查法进行。综上，供试液制备的目的：溶解：避免读数时的干扰；匀质：保证检验样品的代表性；消除抑菌因素：提高检验灵敏度。第45页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：2.菌液制备：2.1 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆
31、菌的新鲜培养物分别接种至营养肉汤培养基中，35培养24h，分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每ml含50100cfu的菌悬液。2.2 将白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，24培养48h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每ml含50100cfu的菌悬液。第46页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：2.菌液制备：2.3 将黑曲霉菌的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，24培养5天，使大量孢子产生。再加入5ml 含0.05(ml/ml)聚三梨脂8
32、0的0.9%无菌氯化钠溶液用无菌玻棒轻轻将孢子洗脱，然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10ml吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05(ml/ml)聚三梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每ml中含50100cfu的孢子悬液。第47页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：3.验证方法：验证试验至少应进行三次独立的平行实验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。3.1 试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分
33、别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验第48页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：3.验证方法：3.1 试验组 菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。3.2 菌液组 测定所加入的试验菌菌数。3.3 供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。第49页，本讲稿共75页Reported by
34、 Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：3.验证方法：3.4 稀释剂对照组 若供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。第50页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数
35、方法的验证：计数方法的验证：3.验证方法：回收率的计算：第51页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply计数方法的验证：计数方法的验证：3.验证方法：结果判断：在3次独立的平行试验中，若稀释剂对照组的菌回收率和试验组的菌回收率均不低于70%，则验证通过。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。第52页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010
36、.12Global Manufacturing and Supply控制菌检查方法的验证：控制菌检查方法的验证：当建立产品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。1.供试液的制备同计数方法验证时的制备方法。2.试验菌种，通常控制菌检查的菌种包括：大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；乙型副伤寒沙门菌；铜绿假单胞菌；生孢梭菌；白色念珠菌。第53页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply控制菌检查方法的验证：控制菌检查方法的验证：3.菌液制备：接种大肠
37、埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物到硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，24培养48h。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。第54页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply控制菌检查方法的验证：控制菌检查方法的验证：4.验证方法：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查（详见中
38、国药典附录XI J 附录111 页 微生物限度检查法）。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。结果判断：若上述试验检出试验菌，则验证通过；若未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。第55页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply控制菌检查方法的验证：控制菌检查方法的验证：4.验证方法：综上，该方法验证没有进行阴性菌
39、对照试验(也就是通常我们进行的：验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌)，因为现在微生物限度检查时需要进行培养基的适用性检查，该阴性菌对照试验已经包括在培养基的适用性检查中，不在重复进行。第56页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物限度检查方法的验证：微生物限度检查方法的验证：5.报告方法：5.1 采用“平均计数稀释倍数”的计算或报告方法；5.2 若在1:10稀释样品中没有检出
40、，报告10cfu/g(ml)；5.3 若平均值有小数，应取整数后乘稀释倍数，例如：1:10稀释样品：平板1:1cfu；平板2：0cfu；平均为0.5。报告结果是10cfu/ml，而不是5cfu/ml。第57页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物限度检查方法的验证：微生物限度检查方法的验证：6.注意事项：6.1 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查。由中国药品生物制品鉴定所研制及分发。6.2 进行验证试验时，若因没有合适的方法消除供试品中的抑菌作
41、用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液应根据供试品应符合微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是每1g供试品细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1X10-3。第58页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物限度检查方法的验证：微生物限度检查方法的验证：6.注意事项：6.3 用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法要求，对用于创伤程度
42、难以判定的局部给药制剂，若没有证据证明药品不存在安全性风险，那么该药品应符合无菌检查法要求。第59页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物限度检查方法的验证：微生物限度检查方法的验证：下列情况应对检查方法进行再验证：下列情况应对检查方法进行再验证：检验方法变更；培养基变更（包括，灭菌参数变更）；产品处方变更。第60页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物限度检查方法的验证：
43、微生物限度检查方法的验证：国际上微生物限度检查方法的主要法规：国际上微生物限度检查方法的主要法规：USP 29 Ph.eur supplement 6th 2.6.13中国药典 附录 XI J JP XV SECTION 35BP 2002 Appendix XVI BTGA guidelines 2004 App17ISO 14730.2 第61页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply四、四、消除供试液抑菌消除供试液抑菌性的方法性的方法第62页，本讲稿共75页Reported by Wa
44、ng Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply微生物检查的主要影响因素：微生物检查的主要影响因素：在药品微生物学检验中，检验结果主要受以下因素影响，药品本身的抑菌性；培养基的促菌生长能力；培养条件(温度、湿度及需氧或厌氧)；过滤系统的材质。第63页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply 其中抑菌因素由于其特殊的重要性而备受关注，因此在微生物检验方法的验证（包括细菌、霉菌及酵母菌计数方法、控制菌检查和无菌实验方法）中尤其重要，也是法规审计
45、中的重点关注点，本部分将着重对其介绍。微生物培养条件也是影响供试品中菌检计数准确与否的重要因素。应注意影响结果的两个方面：一是培养基本身的性质；二是培养条件。通俗说来，培养基应具备应广谱性，即有助于供试品中所有存活微生物的生长。另外，应注意采用最佳培养条件，以确保微生物充分生长并使计数结果呈现良好的重现性。第64页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply消除抑菌性的方法：消除药品抑菌性常见的方法有：化学中和法、稀释法和薄膜过滤淋洗法。根据产品的具体情况，也可将此三 种方法适当组合使用。1.化
46、学中和法当产品具有抑菌作用时，选用一定的化学中和剂，加入其中，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作用。有些化学中和剂在有效消除抑菌作用的同时，对微生物有轻微的伤害作用，这点应在验证过程中注意。搞清产品是否具有抑菌作用是检验方法验证的先决条件。根据检品抑菌作用的大小和药典的通则要求，需设计方案，通过试验确认化学中和剂的浓度、加量及其他有关的检验条件。第65页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply消除抑菌性的方法（续）：抗生素对化学抑制剂并不敏感，在无菌检查中，应根据具体品种采用不同的酶(如青
47、霉素酶)将抗生素活性破坏后，方能进行检验。这类方法均须验证。2.消除产品抑菌性的第二种方法是稀释。实验表明，化学抑菌剂的浓度与其抑菌效果相关。不同抑菌剂在不同浓度下的抑菌作用各不相同。但对某一特定的抑菌剂来说，抑菌剂浓度与抑菌效率呈指数关系。第66页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply消除抑菌性的方法（续）：3.薄膜过滤法 在药品微生物学检验中，尤其是无菌检查，常用薄膜过滤法来消除产品的抑菌性。该法基本原理是当抑菌产品通过滤膜时，微生物被截留在滤膜上，具有抑菌作用的药品被过滤掉，过滤过程
48、消除了药品的抑菌作用。经过滤后，将滤膜置于通常为l00ml的特定培养基内，在适当的条件下培养，观察其是否有微生物生长。第67页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply消除抑菌性的方法（续）：残留于滤膜上的抑菌剂仍有一定的抑菌作用，因此，应尽可能采用对检品具有低吸附性的滤膜(如聚偏四氟乙烯)，以便减少抑菌作用；此外，可通过稀释防腐剂或淋洗滤膜的方式来进一步消除残留物的抑菌作用。所用的稀释液或淋洗液应比较温和，如0.1的蛋白胨水溶液。当淋洗液中需添加化学中和剂时，要保证滤膜上的残留物对截留在滤膜
49、上所有微生物的生长无不良影响。第68页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 2010.12Global Manufacturing and Supply消除抑菌性方法的验证：一、化学中和法 （一）试验方法 按照下列要求配置三组样品：1.样品组 按照常规药品的微生物检验法进行，加入抑菌中和剂，最后接入已知量的菌株(少于100 个菌)，培养计数。2.对照组用蛋白胨代替药品，即以0.1%的蛋白胨溶液作为供试品，菌株接种操作同样品组。3.菌种活性检查组不加抑菌中和剂，将试验菌株直接接种培养。第69页，本讲稿共75页Reported by Wang Yanzhong 201
50、0.12Global Manufacturing and Supply消除抑菌性方法的验证（续）：（二）合格标准 在确定药品抑菌消除方法的验证合格标准时，需兼顾中和剂的效力和毒性两个方面。验证试验的数据应能证明所采用的中和法能有效消除药品的抑菌力(中和剂的效力)，与此同时，它对微生物的正常生长应无不良影响(中和剂的毒性)。达到了这两方面的要求，微生物检验方法即通过了验证。1.如果样品组与对照组的微生物计数相似，表明所用中和剂(中和剂的类别及用量)具有足够的中和效力；2.如果对照组与菌种活性检查组的生长数量相似，表明所用中和剂的毒性不影响微生物的生长。第70页，本讲稿共75页Reported b