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1、第三节 菌种保藏与复壮一、菌种保藏一、菌种保藏菌种保藏的重要意义：菌种保藏的重要意义：菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽成部分。其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的可能设法把菌种的优良特性保持下来而
2、不致向坏的方面转化。方面转化。菌种是国家的重要资源，菌种是国家的重要资源，19801980年我国成立了中国年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会。微生物菌种保藏委员会。第四章 菌种保藏的原理与方法一一 菌种保藏的原理：菌种保藏的原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。以减少其变异。保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等）保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如，创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温
3、、干低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，以降低菌，以降低菌种的代谢活动，减少菌种变异，使菌种处于种的代谢活动，减少菌种变异，使菌种处于“休眠休眠”状态，抑制其繁殖能力，达到长期保存的目的。状态，抑制其繁殖能力，达到长期保存的目的。一个好的菌种保藏方法，应能保持原菌种的一个好的菌种保藏方法，应能保持原菌种的优良优良特性和较高的存活率特性和较高的存活率，同时也应考虑到方法本身的，同时也应考虑到方法本身的经济、简便。经济、简便。二、工业微生物菌种保藏技术：n n1.1.斜面低温保藏法斜面低温保藏法斜面低温保藏法斜面低温保藏法n n2 2矿物油中浸没保藏矿物油
4、中浸没保藏矿物油中浸没保藏矿物油中浸没保藏法法法法n n3 3固体曲保藏法固体曲保藏法固体曲保藏法固体曲保藏法n n4 4砂土管保藏法砂土管保藏法砂土管保藏法砂土管保藏法n n5.5.普通冷冻保藏普通冷冻保藏普通冷冻保藏普通冷冻保藏n n6 6超低温冷冻保藏法超低温冷冻保藏法超低温冷冻保藏法超低温冷冻保藏法n n7.7.冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法n n8.8.液氮冷冻保藏法液氮冷冻保藏法液氮冷冻保藏法液氮冷冻保藏法n n9.9.寄主保藏寄主保藏寄主保藏寄主保藏1.斜面低温保藏n n本方法是利用低温降低菌种的新陈代谢，使菌种本方法是利用低温降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内
5、保持不变。的特性在短时期内保持不变。n n将将新新鲜鲜琼琼脂脂培培养养基基斜斜面面上上长长好好的的菌菌体体或或孢孢子子，置置于于44冰冰箱箱中中保保存存。一一般般的的菌菌种种均均可可用用此此方方法法保保存存1 13 3个月。个月。n n保保存存期期间间要要注注意意冰冰箱箱的的温温度度，不不可可波波动动太太大大，不不能能在在00以以下下保保存存，否否则则培培养养基基会会结结冰冰脱脱水水，造造成成菌种性能衰退或死亡。菌种性能衰退或死亡。n n此此法法最最为为简简单单和和经经济济，且且不不要要求求任任何何特特殊殊的的设设备备。可用于实验室中若干菌种的保藏。可用于实验室中若干菌种的保藏。n n但此方法
6、易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变n n因因此此要要求求在在基基本本培培养养基基上上传传代代为为好好，目目的的是是能能淘淘汰汰突突变株；同时转接菌量应保持较低水平。变株；同时转接菌量应保持较低水平。n n斜斜面面培培养养物物应应在在密密闭闭容容器器中中于于55保保藏藏，以以防防止止培培养养基脱水并能降低代谢活性。基脱水并能降低代谢活性。n n此此方方法法是是一一种种短短期期、过过渡渡的的保保藏藏方方法法此此方方法法，一一般般不不适适宜宜作作工工业业生生产产菌菌种种的的长长期期保保藏藏，一一般般保保存存时时间间为为3636个个月月。如如放放线线菌菌于
7、于4646保保存存，每每3 3个个月月移移接接一一次次；酵酵母母菌菌于于4646保保存存，每每4646个个月月移移接接一一次次；霉霉菌菌于于4646保存，每保存，每6 6个月移接一次。个月移接一次。n n将将琼琼脂脂斜斜面面或或液液体体培培养养物物浸浸入入矿矿物物油油中中于于室室温温或或44冰冰箱箱保保存存，此此方方法法简简便便有有效效。保保存存期期约约1 1年。年。n n可可用用于于丝丝状状真真菌菌、酵酵母母、细细菌菌和和放放线线菌菌的的保保藏藏。特特别别对对难难于于冷冷冻冻干干燥燥的的丝丝状状真真菌菌和和难难以以在在固固体体培培养养基基上上形形成成孢孢子子的的担担子子菌菌等等的的保保藏藏更
8、为有效。更为有效。2.矿物油中浸没保藏n n浸浸没没保保藏藏的的操操作作要要点点是是首首先先让让待待保保藏藏菌菌种种在在适适宜宜的的培培养养基基上上生生长长，然然后后注注入入经经170170下下灭灭菌菌1-2h1-2h的的矿矿物物油油(液液体体石石蜡蜡可可采采用用蒸蒸汽汽灭灭菌菌，灭灭菌菌后后的的石石蜡蜡在在4040烘烘箱箱中中烘烘干干备备用用)。矿矿物物油油的的用用量量以以高高出出培培养物养物1cm1cm为宜。为宜。n n以以液液体体石石蜡蜡作作为为保保藏藏方方法法时时，应应对对需需保保藏藏的的菌菌株株预预先先作作试试验验。因因为为某某些些菌菌株株在在液液体体石石蜡蜡下下生生长长还还十十分分
9、明明显显，有有些些菌菌株株如如某某些些假假丝丝酵酵母母还还会会同同化化液液体体石石蜡蜡，也也有有的的对对液液体体石石蜡蜡保保藏藏敏敏感感。所所有有这这些些菌菌株株都都不不能能用用液液体体石石蜡蜡保保藏藏。为为了了预预防防不不测测，一一般保藏株般保藏株2 23 3年也应做一次存活试验。年也应做一次存活试验。3.固体曲保藏法n n这是根据我国传统制曲原理加以改进的一这是根据我国传统制曲原理加以改进的一种方法，适用于产孢子的真菌。该法采用种方法，适用于产孢子的真菌。该法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体产孢子培养基，使菌种
10、产生大量的休眠体（孢子）后加以保存。该法的要点是控制（孢子）后加以保存。该法的要点是控制适当的水分。适当的水分。4 砂土管保藏法砂土管保藏法n n本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于产孢子的放线菌、霉菌以及产芽孢的息。适用于产孢子的放线菌、霉菌以及产芽孢的细菌。细菌。n n砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3 3：2 2或或1 1：1 1，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，一般沙，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，一般沙用用8080目过筛，土用目过筛，土用8080100100目过筛。按比例混合后，目过筛
11、。按比例混合后，装人小试管内，装料高度约为装人小试管内，装料高度约为1cm1cm左右，左右，121121间间歇灭菌歇灭菌2 23 3次，灭菌后烘干，并作无菌检查后备次，灭菌后烘干，并作无菌检查后备用。用。n n将要保存的菌种斜面孢子刮下，直接与砂土混合；或用无菌水洗下孢子，制成悬浮液，再与砂土混合。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器中，用真空泵抽气干燥后，放在干燥低温环境下保存。此法保存期可达1年以上。5.普通冷冻保藏n由于该法的保藏温度为由于该法的保藏温度为2020，为了避免微生物受损，为了避免微生物受损伤致死，需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为伤致死，需要甘油作为保护剂
12、。甘油的最终浓度为25%25%。n具体操作如下：具体操作如下：配制浓度为配制浓度为5050的甘油溶液，的甘油溶液，121121灭菌后备用；灭菌后备用；制备菌悬液，一般菌悬液的浓制备菌悬液，一般菌悬液的浓度为度为10108 810101010个个mLmL；将菌悬液和甘油溶液以等体将菌悬液和甘油溶液以等体积混合均匀后，置积混合均匀后，置2020保藏。保藏。n或或者者，将将菌菌种种培培养养在在小小的的试试管管或或培培养养瓶瓶斜斜面面上上，待待生生长长适适度度后后，将将试试管管或或瓶瓶口口用用橡橡胶胶塞塞严严格格封封好好，同同上上置置于冰箱中保存。于冰箱中保存。n n用此方法可以维持若干微生物的活力用
13、此方法可以维持若干微生物的活力1212年。年。n n应应注注意意的的是是经经过过一一次次解解冻冻的的菌菌株株培培养养物物不不宜宜再再用来保藏。用来保藏。n n保保藏藏过过程程中中应应注注意意控控制制保保藏藏温温度度，培培养养瓶瓶或或试试管应严格密封。管应严格密封。n n这这一一方方法法虽虽简简便便易易行行，但但不不适适宜宜多多数数微微生生物物的的长期保藏。长期保藏。6.超低温冷冻保藏n n要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在 -6060-80-80-80-80以下进行保藏。以下进行保藏。n n在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：在超低温冷藏柜中保藏菌种
14、的一般方法是：1 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞 2 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3 3加入等体积的加入等体积的2020甘油或甘油或1010二甲亚砜；二甲亚砜；4 4混混匀匀后后分分装装入入冷冷冻冻指指管管或或安安瓿瓿中中，于于-70-70超超低温冰箱中保藏。低温冰箱中保藏。n n如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含1010甘甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在冷冻速度一般控制在1-21-2minmin
15、。若干细菌和真若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏菌菌种可通过此保藏方法保藏5 5年而活力不受影响。年而活力不受影响。7 7冷冻干燥法冷冻干燥法n n其基本原理是在较低的温度下（其基本原理是在较低的温度下（其基本原理是在较低的温度下（其基本原理是在较低的温度下（18181818），快速地），快速地），快速地），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水水分升华。这样菌
16、种的生长和代谢活动处于极低水水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般为为为为5 5 5 510101010年。此法适用于各种微生物。年。此法适用于各种微生物。年。此法适用于各种微生物。年。此法适用于各种微生物。n n具体的做法是先将微生物制成悬浮液，与保护剂具体的做法是先将微生物制成悬浮液，与保护剂具体的做法是先将微生物制成悬浮液，与保护剂具体的做法是先将微生物制成悬浮液，与保护剂（一般为蔗糖、脱脂牛奶或血清等）混合
17、，放在安（一般为蔗糖、脱脂牛奶或血清等）混合，放在安（一般为蔗糖、脱脂牛奶或血清等）混合，放在安（一般为蔗糖、脱脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管内，用低温酒精或干冰（瓿管内，用低温酒精或干冰（瓿管内，用低温酒精或干冰（瓿管内，用低温酒精或干冰（15151515以下）使之速以下）使之速以下）使之速以下）使之速冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，低温保存备用。封，低温保存备用。封，低温保存备用。封，低温保存备用。n n经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运
18、输经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输培养物的冻干过程培养物的冻干过程抽真空抽真空最终菌株浓度一般要求在最终菌株浓度一般要求在10106 6 CFUCFUmlmlCFU代表“colonyformingunits”。CFU/mL指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数。冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生1 1保保藏藏：冷冷冻冻干干燥燥后后的的培培养养物物在在低低于于55下下保保藏藏。较较低低的保藏温度的保藏温度(-20(-20-70)-70)对于培养物的长期稳定更好。对于培养物的长期稳定更好。2 2复苏：复苏：
19、n在在安安瓿瓿中中加加入入0.50.51ml1ml营营养养液液体体培培养养基基，慢慢慢慢旋旋转转安安瓿瓿，使使冻冻干干菌菌种种复复水水。然然后后将将此此转转接接到到一一含含有有再再生生培培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。n在在指指管管中中冻冻干干的的菌菌种种通通常常为为絮絮粉粉状状，可可以以将将此此直直接接振振落落入入盛盛有有l l2ml2ml液液体体培培养养基基的的试试管管中中，轻轻轻轻振振荡荡5 5l0minl0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。8.8.液氮冷冻保藏法液氮冷冻保藏法n
20、液氮超低温保藏法是近几年才发展起来的，此法液氮超低温保藏法是近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。我国国内目前已有很多单位采用液氮法保存菌种。我国国内目前已有很多单位采用液氮法保存菌种。n原理原理 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达度可达196196，远远低于其新陈代谢作用停止的，远远低于其新陈代谢作用停止的
21、温度（温度（130130），所以此时菌种的代谢活动已基），所以此时菌种的代谢活动已基本停止，化学作用亦随之消失。本停止，化学作用亦随之消失。n n9.寄主保藏 适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。菌种保藏的注意事项：1 1菌种在保藏前所处的状态菌种在保藏前所处的状态 一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。菌种进行保存，效果较好。2 2菌种保藏所用的基质菌种保藏所用的基质 碳源碳源 、砂土、砂土 、保护剂、保护剂 3 3操作过程对细胞结构的损害操作过程对细胞结构的损害 冻结速度冻结速度 基因工程菌的保藏n n由由载载
22、体体质质粒粒等等携携带带的的外外源源DNADNA片片段段通通常常是是遗遗传传不不稳稳定定的的、且且很很易易丢丢失失其其外外源源质质粒粒复复制制子子。质质粒粒基基因通常为宿主细胞生长非必需。因通常为宿主细胞生长非必需。n n一一般般情情况况下下当当细细胞胞丢丢失失这这些些质质粒粒时时，生生长长速速度度会会加快加快n n当当培培养养基基中中加加入入抗抗生生素素时时，抗抗生生素素提提供供了了一一有有利利于于携携带带质质粒粒的的细细胞胞群群体体的的极极有有用用的的生生长长选选择择压压力力。而而且且在在运运用用基基因因工工程程菌菌进进行行发发酵酵时时，抗抗生生素素的的加加入可帮助维持质粒复制与染色体复制
23、的协调。入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。n n建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中基中n n例如，质粒例如，质粒pBR322pBR322。它除了能将外源。它除了能将外源DNADNA输入输入E Ecolicoli细胞外，还赋予细胞外，还赋予E Ecolicoli细胞细胞AmprAmpr和和TetrTetr。如。如果在培养基中加入果在培养基中加入Amp(Amp(氨苄青霉素氨苄青霉素)和和TetTet(四环素四环素)，则培养时可选择出含，则培养时可选择出含pBR322pBR322质粒的细胞。质粒的细胞。三.微生物活力和稳定性测定 n n所所
24、有有保保藏藏菌菌种种的的方方法法都都必必须须是是长长期期可可靠靠地地保保持持菌种的优良性状不变。菌种的优良性状不变。n n在在保保藏藏时时定定期期检检测测菌菌种种活活力力，以以确确定定保保藏藏培培养养物物的的保保藏藏期期限限和和保保藏藏方方法法的的可可靠靠性性，以以及及确确定定在在实实际际保保藏藏过过程程中中出出现现的的细细胞胞死死亡亡程程度度和和遗遗传传稳定性。稳定性。n n对对工工业业微微生生物物生生产产菌菌种种来来说说，建建议议保保藏藏菌菌种种的的形形态态学学和和生生化化特特征征(如如代代谢谢产产物物的的产产生生、酶酶活活力力、遗遗传传特特征征及及生生化化指指标标)应应在在保保藏藏后后加
25、加以以检检测测和和确确定。定。n n成成功功的的菌菌种种长长期期保保藏藏方方法法之之有有价价值值的的指指标标包包括括在在保保藏藏6 6个个月月、1 1年年或或更更长长时时间间后后存存活活百百分分率率(或或存存活活单单位位)。细细胞胞群群体体的的形形态态学学特特征征或或一一些些特特别别的的生生化化特特征征应应在在菌菌种种保保藏藏前前后后保保持持同同一一性性，以以及及实实验验室室中中、中中试试车车间间中中和和生生产产发发酵酵中中产产品品滴度的稳定性，后者极为重要。滴度的稳定性，后者极为重要。n n加加速速保保藏藏试试验验可可用用于于预预测测保保藏藏过过程程中中保保藏藏培培养养物物的的稳稳定定性性。
26、在在一一给给定定温温度度下下通通过过对对高高温温下下短短期期活活力力丧丧失失程程度度检检测测，可可以以用用来来预预测测嗜嗜酸酸乳乳杆杆菌的稳定性。菌的稳定性。四.菌种的复壮 生产上使用的菌种，在使用和保藏过程中，经常生产上使用的菌种，在使用和保藏过程中，经常会逐渐向不利于生产的方向发生变化，这种变化称会逐渐向不利于生产的方向发生变化，这种变化称之为之为菌种衰退菌种衰退 一般衰退菌种的复壮措施如下：一般衰退菌种的复壮措施如下：n n纯种分离纯种分离n n淘汰衰退的个体淘汰衰退的个体 n n选择合适的培养条件选择合适的培养条件 五.国内外主要菌种保藏机构介绍n n（1 1）ATCC America
27、n Type Culture CollectionATCC American Type Culture Collection。Rockvil1Rockvil1Maryland.U.S.A.Maryland.U.S.A.美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市.n n（2 2）CSH Cold Spring Harbor Laboratory.U.S.A.CSH Cold Spring Harbor Laboratory.U.S.A.冷泉港研究室，美国冷
28、泉港研究室，美国冷泉港研究室，美国冷泉港研究室，美国.n n（3 3）IAM Institute of Applied Microbiology.University IAM Institute of Applied Microbiology.University of Tokyoof Tokyo，Japan.Japan.日本东京大学应用微生物研究所，日本东京日本东京大学应用微生物研究所，日本东京日本东京大学应用微生物研究所，日本东京日本东京大学应用微生物研究所，日本东京.n n（4 4）IFO Institute for Fermentation.OsakaIFO Institute for
29、 Fermentation.Osaka，Japan.Japan.发酵研究所，日本大阪发酵研究所，日本大阪发酵研究所，日本大阪发酵研究所，日本大阪.n n（5 5）KCC Kaken Chemical Company LtdKCC Kaken Chemical Company LtdTokyoTokyo，Japan.Japan.科研化学有限公司，日本东京科研化学有限公司，日本东京科研化学有限公司，日本东京科研化学有限公司，日本东京.n n（6 6）NCTC National Collection of Type Culture.NCTC National Collection of Type C
30、ulture.LondonLondon，United Kingdom.United Kingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦国立标准菌种收藏所，英国伦敦国立标准菌种收藏所，英国伦敦国立标准菌种收藏所，英国伦敦.n n（7 7）NIH National Institutes of Health.BethesdaNIH National Institutes of Health.Bethesda，MarylandMaryland，U.S.A.U.S.A.国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达国立卫生研究所，美国，
31、马里兰州，贝塞斯达.n n（8 8）NRRL Northern Utilization Research and NRRL Northern Utilization Research and Development DivisionDevelopment Division，U.S.U.S.Department of Department of ArgicultureArgiculture.Peoria.Peoria，U.S.A.U.S.A.美国农业部美国农业部美国农业部美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里北方开发利用研究部，美国皮奥里北方开发利用研究部，美国皮奥里北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市亚市亚市亚市.