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1、第五章第五章 菌种的制备和保藏菌种的制备和保藏5.1 微生物的生长、繁殖5.2 固体孢子的制备5.3 摇瓶种子的制备5.4 菌种保藏第第1 1节节 微生物的生长、繁殖微生物的生长、繁殖一、概述生长就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。单细胞微生物：生长伴随着细胞数目的增加单细胞微生物：生长伴随着细胞数目的增加繁殖繁殖霉菌：细胞生长并不一定伴随着个体数目的增加霉菌：细胞生长并不一定伴随着个体数目的增加生长，而非繁殖生长，而非繁殖如菌丝细胞如菌丝细胞从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程二、细菌的繁殖裂殖是细菌最普遍、最主要的生活方式裂殖是细菌最普遍、最主要的
2、生活方式孢子的产生方式：孢子的产生方式：三、放线菌的繁殖通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可借菌体断裂片段繁殖。借菌体断裂片段繁殖。1.凝聚分裂形成凝聚孢子2.横膈分裂形成横膈孢子3.孢子囊形成孢囊孢子4.分生孢子5.厚壁孢子放线菌的孢子具有较强的耐干燥能力，但放线菌的孢子具有较强的耐干燥能力，但不耐高温，不耐高温，6065oC处理处理1015 min即失即失去生活能力。去生活能力。1）极性生长放线菌的繁殖体以极性伸长方式进行生长通过顶端菌丝的延伸2）分化基内菌丝提供营养物质供气生菌丝生长3）孢子形成4）分枝菌丝分枝一般发生在坚硬细胞壁恢复可塑性时 放线菌的
3、生长方式放线菌的生长方式四、霉菌的繁殖方式主要靠形成无性或有性孢子主要靠形成无性或有性孢子测定群体的增加量测定群体的增加量群体生长群体生长五、微生物生长的测定测定个体的生长没有实际应用价值。测定个体的生长没有实际应用价值。直接法直接法间接法间接法1、直接法又称为全数法又称为全数法a）涂片染色法将定体积的待测液均匀涂布在已知面积的载玻片上，经固定染色后计数b）计数器测定法细菌计数器或血球板计数器c）比浊法简便、快速2、间接法又称为活菌计数法又称为活菌计数法常用平皿菌落计数法活菌计数六、群体生长规律测定生长曲线测定生长曲线第第2 2节节 固体孢子制备固体孢子制备固体孢子是生产种子的一种形式。一般繁
4、殖能力强、孢子数量多的菌种可用固体孢子进罐。孢子进罐的优势：孢子进罐的优势：孢子处于半休眠状态，细胞内的代谢活动降到最低点；孢子处于半休眠状态，细胞内的代谢活动降到最低点；进种子罐后，所有个体都从同一水平起步生长，获得同步进种子罐后，所有个体都从同一水平起步生长，获得同步生长或接近同步生长。生长或接近同步生长。另外，进罐前若将孢子在水中浸泡数小时有利于孢子另外，进罐前若将孢子在水中浸泡数小时有利于孢子快速发芽和同步生长快速发芽和同步生长一、不同菌种的固体孢子制备工艺四环素生产用的孢子制备四环素生产用的孢子制备在茄子瓶斜面上生长周期为在茄子瓶斜面上生长周期为34 d，孢子总数，孢子总数50亿以上
5、。亿以上。1.斜面培养基（斜面培养基（%）2.麸皮麸皮3.琼脂琼脂 麸皮麸皮是主要原料其质量对培养基起决定性的作用采用优质小麦，冲洗后盖湿布使充分均匀的吸水盖闷23 h后晾干水分，磨成片状后过20目筛晾干备用2.斜面孢子培养斜面孢子培养35oC恒温培养恒温培养100 h。培养室内空气湿度不低于培养室内空气湿度不低于30%（3060%）湿度不足菌丝生长缓慢，孢子繁殖数量少湿度不足菌丝生长缓慢，孢子繁殖数量少湿度过大则菌丝疯长，不利于产孢湿度过大则菌丝疯长，不利于产孢培养成熟的斜面孢子每瓶加无菌水培养成熟的斜面孢子每瓶加无菌水4050 ml制成孢制成孢子悬液利用压差接种至种子罐子悬液利用压差接种至
6、种子罐接种量接种量500亿个孢子亿个孢子/m3。二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法1、孢子质量的影响因素、孢子质量的影响因素原材料质量原材料质量培养基配比培养基配比培养条件（温度、培养条件（温度、pH湿度、通气量）湿度、通气量）孢子发育阶段孢子发育阶段孢子数量孢子数量 等等2、固体孢子培养的最佳阶段、固体孢子培养的最佳阶段固体孢子的生长繁殖可划分为三个生理阶段：固体孢子的生长繁殖可划分为三个生理阶段：营养菌丝繁殖营养菌丝繁殖气生菌丝繁殖气生菌丝繁殖分生孢子繁殖分生孢子繁殖繁殖体繁殖体遗传体遗传体以分生孢子进行传代和保存以分生孢子进行传代和保存二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量
7、的方法菌种的遗传基因型；培养条件3、培养基组分的影响、培养基组分的影响碳、氮比例碳、氮比例无机盐无机盐菌丝生长与孢子繁殖的矛盾菌丝生长与孢子繁殖的矛盾限制营养和干燥可以促进孢子生长限制营养和干燥可以促进孢子生长碳、氮过于丰富有利于菌丝的生长不利于孢子繁殖碳、氮过于丰富有利于菌丝的生长不利于孢子繁殖金属离子：金属离子：Mg、Fe、Cu、Mn、Na以及以及P促进孢子形成促进孢子形成二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法通气量4、通气量的控制、通气量的控制抗生素产生菌都是好氧菌抗生素产生菌都是好氧菌通气量均匀一致通气量均匀一致包括各级种子培养采用质量一致的棉塞包括各级种子培养采用质量一致的棉
8、塞（试管、茄瓶、三角瓶等）（试管、茄瓶、三角瓶等）二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法5、培养温度的控制、培养温度的控制多数微生物能在多数微生物能在2437oC生长。生长。最适温度：指细胞新陈代谢活动的适宜温度。最适温度：指细胞新陈代谢活动的适宜温度。有些菌的菌丝最适生长温度与生物合成抗生素的最有些菌的菌丝最适生长温度与生物合成抗生素的最适温度有所差异。适温度有所差异。可在生产的不同阶段控制不同的培养温度。可在生产的不同阶段控制不同的培养温度。二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法6、培养室湿度的控制、培养室湿度的控制固体孢子培养要求适宜的空气湿度。固体孢子培养要求适宜的空气
9、湿度。湿度的变动会影响种子间的差异。湿度的变动会影响种子间的差异。另外需要同时考虑接种量和培养基的水分含量另外需要同时考虑接种量和培养基的水分含量比如大米、小米等培养基质的含水量与菌丝生长有关。比如大米、小米等培养基质的含水量与菌丝生长有关。小米孢子含水量约为小米孢子含水量约为1：1；大米孢子含水量在大米孢子含水量在2427%为宜。为宜。二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法第第3 3节节 摇瓶种子的制备摇瓶种子的制备摇瓶种子：从斜面种子接种入锥形瓶内的液体营养培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。1.配制配制接种接种培养培养接种或保存接种或保存1）菌体浓度（活菌体数）菌体浓度（活
10、菌体数）2.摇瓶种子的质量标准摇瓶种子的质量标准2）菌体生长阶段）菌体生长阶段 对数生长后期对数生长后期1）培养基组成）培养基组成首先要求菌体生长对所有营养成分的需要，首先要求菌体生长对所有营养成分的需要，该前提下培养基组成越丰富，所获得的菌体浓度越高该前提下培养基组成越丰富，所获得的菌体浓度越高3.影响摇瓶种子质量的因素及其控制影响摇瓶种子质量的因素及其控制2）摇瓶装量）摇瓶装量 影响通气效果影响通气效果需要结合产生菌的耗氧特性和摇床的转速需要结合产生菌的耗氧特性和摇床的转速3）摇床转速）摇床转速3.影响摇瓶种子质量的因素及其控制影响摇瓶种子质量的因素及其控制4）摇瓶在摇床中的位置）摇瓶在摇
11、床中的位置4.孢子接入量孢子接入量第第4 4节节 菌种保藏菌种保藏菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的一、菌种保藏的目的菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。方面的需要。二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行首先应该挑选典型菌种的优良
12、纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：其次应人为地创造环境条件（如：干干燥、低温和缺氧燥、低温和缺氧），使微生物长期处），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先一
13、种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性、操作的简便性和设备的普及性。性。低温是保藏菌种的重要因素之一一般微生物在-30oC时即停止生长低温处理菌种时要注意对细胞的损伤因为细胞外的培养基比细胞内物质结冰早可加保护剂甘油常用的保藏方法常用的保藏方法1 1、定期移植保藏法、定期移植保藏法2 2、斜面冰箱保藏法、斜面冰箱保藏法 4 C ；3-6个月个月3 3、液体、液体石蜡保藏法石蜡保藏法 1年左右年左右4 4、菌丝速冻、菌丝速冻 甘油或二甲基亚砜作为保甘油或二甲基亚砜作为
14、保 护剂，护剂，-20 C 5 5、沙土保藏法、沙土保藏法 产孢子或芽孢微生物，产孢子或芽孢微生物，57年年6 6、真空冷冻干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般任何微生物；一般5年以上年以上7 7、液氮超低温保藏法、液氮超低温保藏法 -196 C；保护剂；保存期长；保护剂；保存期长（一）斜面低温保藏法（一）斜面低温保藏法常用保藏法常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于后，置于44左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，期）再转接至
15、新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法的主要保藏措施是低温。一般可保存此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1 16 6 个月左右。个月左右。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点 是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期 短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污 染。染。（二）石蜡油封藏法（二）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体此法是在无菌条
16、件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体 石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端上，石蜡油层高出斜面顶端1cm1cm，使培养物与空气隔绝，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或44冰箱内冰箱内 保藏。保藏。此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保 存存1 12 2年左右。年
17、左右。不适合严格厌氧菌不适合严格厌氧菌（三）沙土管保藏法（三）沙土管保藏法一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的 微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的 细菌及酵母则不适用。细菌及酵母则不适用。n砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等 诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物 移接方便，经济简便。它的保藏期约移接方便，经济简便。它的保藏期约1 11010年。年。n 该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例该法
18、是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约分装于小试管中，砂土的高度约1cm1cm，121121蒸汽灭菌蒸汽灭菌1 1，间歇灭菌间歇灭菌3 3次。次。5050烘干后经检查无误后备用。将待保藏烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约空约2 24h4h，用火焰熔封管口用火焰熔封管口(或用石蜡封口或用石蜡封口)，置于干燥，置于干燥器中，在室温或器中，在室温或44冰箱内保藏。冰箱内
19、保藏。（四）麸皮保藏法（四）麸皮保藏法又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然 后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水 以一定的比例拌匀，装量为试管体积以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/52/5，湿热灭菌后经，湿热灭菌后经 冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将 试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干 燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔燥数日后移入低温
20、下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔 封，再保藏，则效果更好。封，再保藏，则效果更好。此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在期在1 1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。多采用。（五）甘油悬液保藏法（五）甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用度若采用2020，保藏期约为，保藏期约为1 1年，而采用年，而采用7070，保藏期可达，保藏期可达1010年。年。将
21、拟保藏菌种对数期的培养液直接与经将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121121蒸汽灭菌蒸汽灭菌20min20min的甘油混合，并使甘油的终浓的甘油混合，并使甘油的终浓度在度在10101515，再分装于小离心管中，置，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。基因工程菌常采用本法保藏。（六）冷冻真空干燥保藏法（六）冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽
22、真空，使水升华将样品温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。处于休眠状态，而得以长期保藏。n 此法适用于各大类微生物。此法适用于各大类微生物。n 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有 保护剂，保藏期一般长达保护剂，保藏期一般长达5 51515年，存活率高，年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的变异率
23、低，是目前被广泛采用的一种较理想的 保藏方法。保藏方法。n 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻 干机等设备。干机等设备。（七）液氮超低温保藏法（七）液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（为保护剂，在液氮超低温（196196）下保藏的方法。其）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免
24、膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到般可达到1515年以上，是目前公认的最有效的菌种长期年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。备，且液氮消耗较多，操作费用较高。（
25、八）宿主保藏法（八）宿主保藏法此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。立克次氏体等）。植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。液，然后分装于试管中密封，低温保存。在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保 藏法、石蜡油封藏法、宿主
26、保藏法最为简藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简 便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬 液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和 液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效 果最好。应用时，可根据实际需要选用。果最好。应用时，可根据实际需要选用。美国美国ATCCATCC采用冷冻干燥保藏法和采用冷冻干燥保藏法和 液氮保藏法来保藏所有菌种。液氮保藏法来保藏所有菌种。我国我国CCCCMCCCCM采用斜面低温保藏法、采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进 行菌种保藏。行菌种保藏。