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1、 大型仪器管理中心黄雪玲2010-9-27实时荧光定量实时荧光定量PCR原理及其应用原理及其应用荧光定量PCR仪的应用v基础研究中基因表达丰度的测定；v差异基因的表达检测，基因型分析；v临床医疗领域病原体的检测和基因诊断：包括特定基因的检测、细菌和病毒等病原体的检测；v环境监测，包括水质、空气的污染检验；v检验检疫工作：食品卫生检验，转基因作物的检验；v法医的遗传学鉴定；PCR的反应过程的反应过程CycleFluorescence实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR（Real-time Q-PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后通过参
2、照标准曲线对反应体系中未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR中的三个概念增长曲线增长曲线 (primary curve)荧光阈值（荧光阈值（threshold)CT 值值(Cycle Threshold)增长曲线增长曲线 反映荧光强度与循环数的对应关系反映荧光强度与循环数的对应关系CycleFluorescence域值域值：PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。荧光域值（荧光域值（Threshold）的设定的设定Ct值值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系值与起始模板的
3、关系 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，CT值越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越大。一般正常的CT值范围在15-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。荧光定量荧光定量PCR标记方法标记方法 内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探针序列特异性探针TaqmanTaqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 AmplifluorAmplifluor(IntergenInterg
4、en)5353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I SYBR Green I优点：u使用方便，可以应用于不同的模板u灵敏，便宜缺点：u与非特异性产物结合，但可以通过熔解曲线进行辨别熔解温度(Tm值)Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性。Melt Curve AnalysisRQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记
5、探针（双标记探针（Taqman Probe）优点：u对目标序列有很高的特异性，在病原微生物特异性检测上有独特优势u设计简单，准确性好缺点：只适合于一种特异目标的检测，相对价格略高双标记探针（Taqman Probe）荧光定量PCR实验技术路线v查询目的基因序列 v选择合适的荧光标记方法 选染料法则购买SyBr Green I或相应试剂盒；探针法则设计并合成荧光探针v 设计特异引物或探针引物设计的一般原则：引物设计的一般原则：u产物长度在产物长度在80-300bp80-300bp之间之间u产物产物GCGC含量在含量在50-60%50-60%之间之间u引物的引物的GCGC含量在含量在50-60%5
6、0-60%之间，熔解温度在之间，熔解温度在55-6555-65之间之间u应避免引物中有连续的应避免引物中有连续的G G或或C C，但推荐在引物的末端含有，但推荐在引物的末端含有G G或或C C Primer 5.0 http:/ 模板浓度：在普通PCR基础上可以稀释10100倍 引物浓度：0.4 0.9 M（一般略低于PCR引物量）荧光物质浓度：按说明书操作，根据实验结果优化 加样准确性：避免微小加样荧光定量PCR实验技术路线v模板v Plasmid DNA 目的片段在Plasmid DNA 中很易被扩增，可以适当稀释 Total DNA 目的片段在Total DNA中丰度相对较低，因此Tot
7、al DNA量要略高于Plasmid DNA cDNA 以cDNA为模板时一般将反转录产物原液稀释1050倍后作模板荧光定量PCR实验技术路线v荧光定量PCR反应灵敏，微小差异都能被反映，实验中要避免核酸污染，尤其是避免PCR产物污染。v试剂反复冻融对实验也有影响，各组分采用少量分装保存v低浓度模板反复冻融容易降解，少量分装保存定量方法v绝对定量v相对定量标准曲线标准曲线由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的浓度log N0=-Ct logE +logN绝对定量绝对定量未知浓度的样品与标准曲线相比较未知浓度的样品与标准曲线相比较绝对定量v标准品：含有目的片段的浓度已知的核酸v绘制标
8、准曲线时，一般选取4-5个点（多于5个更好），被选点的模板浓度范围要包括待测样本浓度相对定量相对定量在一定样本中靶基因相对于另一参照在一定样本中靶基因相对于另一参照样本的量的变化样本的量的变化 v只需要了解相对于参照样本目的基因的表达量的变化量，而不需要确切的知道基因的表达量具体是多少，采用相对定量即可。v比较的依据是实验时不同样本的总核酸模板一致v用表达量基本恒定的看家基因作为内参照来体现上样模板的量u比较CT法（CT）前提：每个循环增加一倍的产物数量，靶基因和看家基因的扩增效率基本一致u双标准曲线法 利用两组标准曲线分别得到目的基因及持家基因的表达量 样本目的基因表达量=相对定量方法相对定
9、量方法目的基因标准曲线测得值持家基因标准曲线测得值目标基因与持家基因扩增效率差别举例目标基因与持家基因扩增效率差别举例 对于每一个稀释梯度，都用 GAPDH 和 c-myc 引物进行扩增。计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT值以及CT值，通过 cDNA 浓度梯度的 log 值对CT值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于 0，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过 C T 方法进行相对定量。Kenneth J.Livak and Thomas D.Schmittgen,METHODS 25,402408(2001)相对定量方法二相对定量方法二双标准曲线法双标准曲线法 当两个扩增反应效率不同或者不方便证明的时候，则需要通过双标准曲线的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。v对于所用的标准品只要知道其稀释比例即可。v最终结果必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。v在反应中同时扩增一内源控制物，如持家基因等以标准化起始模板的量谢 谢!