《荧光定量PCR原理及应用科研版.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光定量PCR原理及应用科研版.ppt（138页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、东胜创新生物科技有限公司东胜创新生物科技有限公司东胜创新生物科技有限公司东胜创新生物科技有限公司实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介技术简介应用工程师应用工程师 张晓辉张晓辉东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之OUTLINEOUTLINE实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理荧光定量荧光定量PCR仪简介仪简介实时荧光定量实时荧光定量PCR在科研上的应用在科研上的应用实时荧光定量实时荧光定量PCR实验设计实例实验设计实例东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实
2、时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 OUTLINEOUTLINE实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理常规常规PCRPCR技术：技术：PCR后借助电泳对扩增反应的后借助电泳对扩增反应的终产终产物物进行定量及进行定量及定性定性分析分析DNA EngineS1 S2 M常规常规常规常规PCRPCR东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPC
3、RPCR原理原理原理原理 常规常规常规常规PCRPCR常规常规PCRPCR结合结合电泳分析方法的缺点电泳分析方法的缺点只能对终产物进行分析只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量无法对起始模板准确定量必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析,费时费事费时费事无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测EB有毒有毒东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Opticon实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理定量定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应扩增反应中中每一个
4、循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准曲线实现对和标准曲线实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析定量定量定量定量PCRPCR东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理实时荧光定量实时荧光定量PCR三个关键词：三个关键词：实时，荧光，定量实时，荧光，定量如何如何实时实时检测？检测？借助借助荧光荧光物质示踪扩增产物量的变化物质示踪扩增产物量的变化定量定量定量定量PCRPCR东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理
5、原理原理在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质，随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化荧光曲线荧光曲线荧光曲线荧光曲线东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值值和标准曲线实现对和标准曲线实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析引入两个概念：引入两个概念：荧光阈值、荧光阈值、Ct值值实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 定量原理定量原理定量原理定量原理东胜创新东胜创新
6、东胜创新东胜创新荧光阈值荧光阈值荧光阈值荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准光强度标准(即即PCRPCR扩增产物量的标准扩增产物量的标准)Threshold line C(t)value 实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 定量原理定量原理定量原理定量原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 定量原理定量原理定量原理定量原理CtCtCtCt值的概念值的概念值的概念值的概念Ct值的定义是值的定义是PCR扩增过程
7、中，扩增产物扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数次数Threshold line C(t)value 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新qLogLog浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性关系关系q初始初始 模板量越多模板量越多,扩增产扩增产物达到某一值（域值）物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少时所需要的循环数越少确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 定量原理定量原理定量原理定量原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧
8、光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 定量原理定量原理定量原理定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新定量原理定量原理实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:log N=log X0(1+Ex)
9、Ct (2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log N (3)LogLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新 定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线出标准曲线,通过未知样品的通过未知样品的CtCt值值,从标准曲线上从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。计算出该样品的起始浓度。如何定量如何定量荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C
10、(T)循环数标准曲线循环数标准曲线.未知未知10410310610510210实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新 Determine C(t)value for unknownDetermine C(t)value for unknown Interpolate quantity of unknown Interpolate quantity of unknown using the standard curveusing the standard curveunknown104103Unknown cont
11、ains 3108 copies实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理阈值的选择阈值的选择阈值的选择阈值的选择荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-153-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍倍 东胜创新东
12、胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理为什么要用为什么要用为什么要用为什么要用CtCtCtCt值定量值定量值定量值定量实时荧光定量实时荧光定量PCR方法利用方法利用CtCt的概念，的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该样品间的细小误差尚未放大，因此该CtCt值具有极好的重复性。值具有极好的重复性。东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 相同模板在同一台相同模板在同一台PCR
13、仪上相同条件下重复仪上相同条件下重复96次次扩增的扩增曲线图扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性值则极具重现性 CtCt值的重现性值的重现性东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之与传统与传统与传统与传统PCRPCR的比较的比较的比较的比较Absolute quantification is possibleAbsolute quantification is possibleSensitiveSensitiveDetects lower copies
14、of targetDetects lower copies of targetDetects small fold differencesDetects small fold differencesSamples with a broad range of Samples with a broad range of concentrations are analyzed without concentrations are analyzed without normalizing concentrationnormalizing concentrationCost effective and
15、time efficientCost effective and time efficientFlexible assay designFlexible assay design东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 OUTLINEOUTLINE实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理示踪扩增产物量变化的示踪扩增产物量变化的
16、荧光物质荧光物质及及其其工作原理工作原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新qSYBR Green 1qMolecular Beaconsq TaqMan荧光化学荧光化学荧光化学荧光化学MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green 1SYBR Green 1MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新SYBR Green I SYBR Green
17、 I 工作原理工作原理工作原理工作原理MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 qSYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位qSYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Bound SYBR Green IUnbound SYBR Green IPCR SYBR Green I fluorescence SYBR Green I fluorescence increases upon binding
18、increases upon binding dsDNAdsDNA Post-amplification melting Post-amplification melting curve analysiscurve analysisMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理工作原理工作原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理工作原理工作原理MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列
19、实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新SYBR Green I SYBR Green I 优点优点优点优点q使用方便 -不必设计复杂的荧光探针 q没有序列特异性 -可以用于不同的模板 q便宜 q灵敏MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新SYBR Green I SYBR Green I 缺点缺点缺点缺点q与非特异性产物结合与非特异性产物结合MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新
20、东胜创新东胜创新 Graph fluorescence intensity vs.temperatureGraph fluorescence intensity vs.temperature Decreasing fluorescence recordedDecreasing fluorescence recorded Due to increasing temperatureDue to increasing temperature Due to denaturation and release of SGIDue to denaturation and release of SGI Tm
21、is the point of inflection on the melting curveTm is the point of inflection on the melting curveTemperature increasesFluorescencedecreasesTmMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之SYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Plot the negative of the rate of change o
22、f Plot the negative of the rate of change of fluorescence vs.temperature(-dI/dT)fluorescence vs.temperature(-dI/dT)-dIdTTmMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之SYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之SYBR Gre
23、en I SYBR Green I 融解曲线分融解曲线分融解曲线分融解曲线分析析析析Identical reaction components,except initial template concentration varies10,000 copiesNon-specific productAmpliconAmplicon10 copies东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新10,000 copies10 copies0 copies Melting curve resultsAmplification results1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.6
24、3oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.Plate Read6.84oC for 1 sec7.Plate Read8.Go to line 2 39 more times9.Melting curve from 65oC to 95oC,read every 0.2oC,hold 1 sec.MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 SYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新10,000 copies10 copi
25、es0 copies Melting curve resultsAmplification results1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.63oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.Plate Read6.84oC for 1 sec7.Plate Read8.Go to line 2 39 more times9.Melting curve from 65oC to 95oC,read every 0.2oC,hold 1 sec.MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪
26、之仪之 SYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新For reliable nucleic acid quantification,each primer set requires individual optimizationParameters used to optimize reaction specificity and efficiencyPrimer design Amplicon designConcentration of reagentsCycling conditionsDenatu
27、ration and annealing temperaturesMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 Real-time PCRReal-time PCR体系优化体系优化体系优化体系优化东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Dynamic thermal gradient allows for one-step reaction-temperature optimizationUp to 24oC gradient rangeMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之
28、Real-time PCRReal-time PCR体系优化体系优化体系优化体系优化东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新45oC55oC65oCMelting curve resultsAmplification results1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.83oC for 1 sec6.Plate Read7.Go to line 2 39 more times8.Melting curve from 65oC to 95oC,readever
29、y 0.2oC,hold 1 sec.MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 Real-time PCRReal-time PCR体系优化体系优化体系优化体系优化东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新SYBR Green I SYBR Green I 应用范围应用范围应用范围应用范围q起始模板浓度定量q融解曲线分析-可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体q基因型分析MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Molecular
30、BeaconsMolecular BeaconsMolecular BeaconsMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 发夹型杂交探针发夹型杂交探针东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Molecular BeaconsMolecular Beacons原理：荧光谐振能量传递（原理：荧光谐振能量传递（FRET）茎由互茎由互补补配配对对的序列的序列组组成成环环与目与目标标序列完全配序列完全配对对茎茎MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂环环东胜
31、创新东胜创新东胜创新东胜创新变变变变性性性性:产生产生产生产生非特异性的荧光非特异性的荧光非特异性的荧光非特异性的荧光Molecular BeaconsMolecular BeaconsMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Target-loop interaction more stable than stem-stemTACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuring the annealing step:During the annea
32、ling step:Probe binds targetProbe binds target Reporter and quencher separatedReporter and quencher separated Target-specific fluorescenceTarget-specific fluorescenceMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 Molecular BeaconsMolecular Beacons 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新延伸延伸延伸延伸:没有没有没有没有荧光荧光荧光荧光Molec
33、ular Beacons SNPMolecular Beacons SNPOpticonOpticon实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Molecular Beacons Molecular Beacons 实验结果实验结果实验结果实验结果MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 Molecular BeaconsMol
34、ecular Beacons实验程序实验程序实验程序实验程序1.9451.9451.9451.945minmin2.95 2.95 5555secsec3.58 3.58 30303030secsec4.4.Plate readPlate read 5.72 5.72 30303030secsec6.Goto step 2 for more 39 times6.Goto step 2 for more 39 times东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Molecular Beacons Molecular Beacons 应用范围应用范围应用范围应用范围q定量起始模板定量起始模板浓浓度度q基因型
35、分析基因型分析q鉴鉴定定产产物物q单单核苷酸核苷酸多多态态性（性（SNP）检测检测MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Molecular Beacons SNPMolecular Beacons SNPTACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQ荧光素目标序列茎淬灭剂MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Molecular Beacons Molecular B
36、eacons 优点优点优点优点q对目标序列有很高的特异性对目标序列有很高的特异性 用于用于SNPSNP检测的最灵敏的试剂之一检测的最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Molecular Beacons Molecular Beacons 缺点缺点缺点缺点q设计困难设计困难q无终点分析功能无终点分析功能q只能用于一个特定的目标只能用于一个特定的目标q价格较高价格较高MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪
37、之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新TaqManTaqMan探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 TaqMan水解型杂交探针水解型杂交探针东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新TaqManTaqManq目标特异性探针q5 为荧光素，3 为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新RQReporterQuencherRQIntact probe-reporter
38、quenched by FRETFRRQDuring PCR,probe hybridizes to target sequenceRQProbe is partially displaced during extensionRQProbe cleaved by 5-3 nuclease activity of polymeraseRQFree reporter exhibits unquenched fluorescenceMJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之TaqMan TaqMan 工作原理工作原理工作原理工作原理东胜创
39、新东胜创新东胜创新东胜创新TaqMan TaqMan 实验结果实验结果实验结果实验结果MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 TaqManTaqMan实验程序实验程序实验程序实验程序1.9451.9451.9451.945minmin2.95 2.95 5555secsec3.58 3.58 30303030secsec4.4.Plate readPlate read 5.Goto step
40、2 for more 39 times5.Goto step 2 for more 39 times6.end6.end东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新TaqMan TaqMan 应用范围应用范围应用范围应用范围q定量起始模板浓度定量起始模板浓度q基因型分析基因型分析q产物鉴定产物鉴定qSNPSNP分析分析MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新TaqMan TaqMan 优点优点优点优点q对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测q与 Molecular Beacons 相比设计相 对简单
41、MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新TaqMan TaqMan 缺点缺点缺点缺点q价格较高q只适合于一个特定的目标q不能进行融解曲线分析q背景高 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新兼容化学试剂总结兼容化学试剂总结兼容化学试剂总结兼容化学试剂总结结合于双链结合于双链DNA的小沟的小沟中中发夹型杂交探发夹型杂交探针针水解型杂交探水解型杂交探针（针（5-3外切）外切）延伸延伸复性复性任何任何步骤步
42、骤定量和检测目标基因定量和检测目标基因融解曲线分析融解曲线分析SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因信号检测信号检测工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂化学试剂化学试剂否否有有有有主要应用范围主要应用范围MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之 东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 OUTLINEOUTLINE实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学
43、双通道与内标基因分型（SNP）检测东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之双通道与内标双通道与内标准确的相对定量方法准确的相对定量方法-内标法内标法-解决模板提取过程中造成的差别解决模板提取过程中造成的差别-解决样品材料不均一造成的差别解决样品材料不均一造成的差别-解决加样过程中的差别解决加样过程中的差别东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之内标法内标法内标法必须：内标法必须：在一个在一个PCRPCR管
44、中进行两种管中进行两种PCRPCR反应：反应：q一个是有差别的（目标一个是有差别的（目标RNA或或DNA）q一个是无差别的（内标一个是无差别的（内标RNA或或DNA）东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之内标法内标法q内标的种类内标的种类1.看家基因看家基因2.添加添加DNA或或RNA东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量PCR技术之技术之 多色双通道技术多色双通道技术多色双通道技术：多色双通道技术：q多色：可使用多种荧光染料多色：可使用多种荧光染料q双通道：可同时测定两种荧光染
45、料双通道：可同时测定两种荧光染料 发出的荧光发出的荧光东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新一个一个PCRPCR管内进行两种管内进行两种PCRPCR扩增要解决的问扩增要解决的问题：题：1 1、引物及探针问题、引物及探针问题-引物及探针的相引物及探针的相 互干扰互干扰2 2、模板量差别、模板量差别-共用资源的相互竞争共用资源的相互竞争实时荧光定量实时荧光定量PCR技术之技术之 多色双通道技术多色双通道技术东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新FRRQFRRQFRRQRQ实时荧光定量实时荧光定量PCR技术之技术之 多色双通道技术多色双通道技术1、引物及探针问题、引物及探针问题东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新F
46、RRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ2、共用资、共用资 源的相互竞争源的相互竞争实时荧光定量实时荧光定量PCR技术之技术之 多色双通道技术多色双通道技术东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ解决办法：解决办法：单双通道同时进行，相互验证单双通道同时进行，相互验证实时荧光定量实时荧光定量PCR技术之技术之 多色双通道技术多色双通道技术单单单单双双东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量PCR技术之技术之 多色双通道技术多色双通道技术解决办法之二：解决
47、办法之二：primer limiting东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 OUTLINEOUTLINE实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新FRFQCVQTCSNP G/AFQCVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probe用用TaqManTaqMan探针进行基因型分析探针进行基因型分析实时荧光定量实时荧
48、光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术之技术之技术之技术之 SNPSNP检测检测检测检测-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新QF5CGQ53GCFQV53GTQ53Hybridization of TaqMan ProbeDigestion of probe-fluorescenceNO digestion of probe-NO fluorescenceTVQCFQMatch for Allele 1Reduced Efficiency of Probe HybridizationMismatch for Allele 1Polymerase实时
49、荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术之技术之技术之技术之 多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新q从病人血液样品中提取 DNA q基因型分类：qA/A(Allele 1)qG/G(Allele 2)qG/A(Heterozygote)CFQTVQ实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术之技术之技术之技术之 多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析东胜创新东胜创新东胜创
50、新东胜创新Allele 1 controlVICFAM实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术之技术之技术之技术之 多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Allele 2 controlVICFAM实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术之技术之技术之技术之 多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用多色双通道技术应用-基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Heterozygote contro