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1、聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR1、反转录、反转录PCR(RT-PCR)2、反向、反向PCR3、复合、复合PCR4、不对称、不对称PCR 5、嵌套、嵌套PCR6、实时定量、实时定量PCRPCRPCR的技术类型的技术类型PCRPCRPCR技术的基本原理技术的基本原理技术的基本原理类似于类似于DNADNA的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增DNADNA模板加模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在再将温度升高使退火引物在DNADN
2、A聚合酶作用下聚合酶作用下得以延伸。这种热变性得以延伸。这种热变性-复性复性-延伸的过程就是延伸的过程就是一个一个PCRPCR循环，循环，PCRPCR就是在合适条件下的这种循就是在合适条件下的这种循环的不断重复环的不断重复。PCR的操作步骤的操作步骤模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93-95左右一定时左右一定时间后间后,使模板使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离解离,使使之成为单链之成为单链,以便它与引物结合以便它与引物结合,为下轮反应作准备；为下轮反应作准备；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板D
3、NADNA经加热变性成单链经加热变性成单链后后,温度降至温度降至5555左右左右,引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结单链的互补序列配对结合；合；引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，以下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板留复制原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链。链。注注:每完成一个循环需每完成一个循环需2 24 4分钟，分钟，2 23 3小时就能将待扩目的小时就能将待扩目的基因扩增放大几
4、百万倍基因扩增放大几百万倍1、缓冲溶液、缓冲溶液 Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂 2、耐热、耐热DNA聚合酶聚合酶3、脱氧核糖三磷酸核苷酸、脱氧核糖三磷酸核苷酸(dNTPs)4、模板、模板DNA5、上游引物、下游引物、上游引物、下游引物（1）、）、PCR反应缓冲液反应缓冲液Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量产量下降；下降；Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系
5、中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。浓度。（2）Taq DNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)0.5-5 U/100 L 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量酶量过少影响反应产量。（3）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTP浓度应相等浓度应相等,一般为一般为50-200 mol/L 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产 量量 dNTP可与可与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓
6、度下降，影响浓度下降，影响DNA聚聚合酶的活性。合酶的活性。（4）模板）模板 单、双链单、双链DNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。一般一般100ng DNA模板模板/100 L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（5）引物浓度）引物浓度 0.1-1 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则引引物物长长度度一一般般以以1530bp为为宜宜,过过短短则则降降低低特
7、特异异性性，过过长长则则会会引引起起引引物物间间退火而影响有效扩增。退火而影响有效扩增。避避免免引引物物内内部部出出现现二二级级结结构构，避避免免序序列列内内有有较较长长的的回回文文结结构构，使使引引物物自自身不能形成发夹结构。身不能形成发夹结构。G/C和和A/T碱碱基基均均匀匀分分布布，G/C含含量量在在4555%之之间间，引引物物碱碱基基序序列列尽尽可可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。要要避避免免两两个个引引物物间间特特别别是是3末末端端碱碱基基序序列列互互补补以以及及同同一一引引物物自自身身3末末端端碱基序列互补的，使它们不
8、能形成引物二聚体或发卡结构。碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。引引物物3末末端端碱碱基基一一般般应应与与模模板板DNA严严格格配配对对，并并且且3末末端端为为G、C或或T时时引发效率较高。引发效率较高。引引物物5末末端端碱碱基基可可不不与与模模板板DNA匹匹配配，可可添添加加与与模模板板无无关关的的序序列列(如如限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的识识别别序序列列、ATG起起始始密密码码子子或或启启动动子子序序列列等等)，便便于于克克隆隆和和表达，但其保护碱基有一定的要求。表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源
9、性。（1 1）变性）变性 使双链DNA解链为单链,95 35分钟 (2)(2)退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GC含量决定含量决定,适宜的退火温度大约低于引物适宜的退火温度大约低于引物Tm值值45-55，介于，介于45-55。增加温度能减少引物与模板的非特。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸）延伸 7272，延伸时间由扩增片段长度决定，延伸时间由扩增片段长度决定（4 4）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次
10、数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加标准的准的PCR反反应条件条件10缓冲液缓冲液 10 L4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物引物 各各10100pmol模板模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶聚合酶 2.5UMg2+1.5mmol/L（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EPEP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，器皿及工作区域要分开，无菌操作无菌操作（二）设立对照二）设立对照阳性对照：阳性对照：阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照：阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照：除模板外除模板外的所有组分的所有组分PCRPCR反
11、应的特点反应的特点灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6-6)水平水平2.2.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.3.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU4.4.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1.1.一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 h4 h完成扩增完成扩增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组
12、血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提织等组织的粗提DNADNA1.基础研究基础研究基因或基因或 cDNA 克隆：从基因数据库中获得某一基因或克隆：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 核苷酸序列核苷酸序列,用用 PCR 方法扩增并克隆该基因或方法扩增并克隆该基因或 cDNA。基因表达：用基因表达：用 RT-PCRRT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。检测某一特定基因在转录水平的表达。2.医学医学感染性疾病病原体的诊断：感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核杆菌、乙肝病毒等。结核杆菌、乙肝病毒等。遗传病相关基因检测：镰刀型细胞贫血、血友病。遗传病相关基因检测：镰刀型细胞贫血、血友病。恶性肿瘤的诊断恶性肿瘤的诊断。3.法医学中的基因和亲子鉴定法医学中的基因和亲子鉴定4.考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定5.基因动、植物的检测基因动、植物的检测转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因植物的检测：玉米、大豆等。转基因植物的检测：玉米、大豆等。