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1、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?答:这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中 外源外源DNA载体载体DNA重组分子重组分子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞扩增或表达扩增或表达表达表达连接连接转化或转导转
2、化或转导电穿孔或显微注射电穿孔或显微注射受体细胞受体细胞载体去磷防止连接反应中的载体自连载体去磷防止连接反应中的载体自连POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶2Pi寄主修复缺口寄主修复缺口载体自连或产载体自连或产生二具体等生二具体等2、目的基因与载体的连接、目的基因与载体的连接一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的连接酶把相互靠近的5端磷酸端磷酸与与3-OH连到一起。连到一起。第一节第一节 DNA片段的体外连接片段的体外连接1.两段两段DNA的连接的连接依靠粘性末端依靠粘性末端2.DNA片断与载体的
3、连接片断与载体的连接依靠粘性末端依靠粘性末端二、齐平末端（二、齐平末端（blunt end）的连接）的连接5端与端与3端并列靠近的时间太短，不容易端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。被连接酶连接。1.直接连接直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3-OH-PP-HO-5 3 1972年，斯坦福大学的年，斯坦福大学的P.Labban和和P.Kaiser提出。提出。（1）同聚加尾）同聚加尾 法法 2.人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端
4、粘性末端”DNA末端转移酶末端转移酶能在没有模板的情况下能在没有模板的情况下给给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾加尾碱基互补碱基互补缺点缺点：优点优点：能把任何能把任何片段连接片段连接起来起来不能把不能把插入片插入片段再切段再切下来。下来。非酶切位点非酶切位点用用T4 DNA连接酶连到平端连接酶连到平端DNA上，然上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物）衔接物(linker)连接连接 linker用化学合成法合成的一段用化学合成法合成
5、的一段10-12bp的特定限的特定限制性内切酶识别位点序列的制性内切酶识别位点序列的平端双链平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：linker的作用的作用缺点：缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段切下完整的插入片段2）能给载体连接上）能给载体连接上Polylinker:优点：优点：（3）DNA接头接头(adapter)连接法连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 B
6、amHI adapter用用T4DNA连接酶连到连接酶连到DNA分子的两分子的两端，直接成为人工粘性末端。端，直接成为人工粘性末端。adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。切位点序列）。adapter的作用的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接接头
7、自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与影响与DNA片段的连接。片段的连接。优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先用小牛肠先用小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶（CIP）处理接头，）处理接头，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。端的磷酸，防止自我连接。（以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我连接防止自我连接5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键
8、自我连接！接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处理处理-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5GATCCCGG-HO-GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG5 5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNADNA片断连接。片断连接。PCR产物的连接产物的连接1.在引物的在引物的5端设计酶切位点端设计酶
9、切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的多克隆位点；（1）设计原则）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构3端端1520bp与模板互补；与模板互补；5端端610bp是某个内切酶的识别序列。是某个内切酶的识别序列。（5端多余的端多余的35bp属属保护碱基保护碱基）避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。引物引物1GCAGAATTC 互补序列互补序列模板模板EcoRI位点位点5-3 GCAGAATTC 互补序列互补序列5-3 3 模板模板GCAGAATTC 互补序列互补序列 PCR产物产物5-3 3 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3
10、 3 GCTAGCCGG 互补序列互补序列模板模板BamH I 位点位点-5 3-5 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列互补序列-5 3-模板模板5 GCTAGCCGG PCR产物产物 互补序列互补序列-5 3-引物引物2带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTC PCR产物产物5-3 GCTAGCCGG PCR产物产物-5 3-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点位点BamHI位点位点AATTC PCR产物产物5-3 GCTAG PCR产物产物-5 3-GCEcoRI BamHI两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！2.与与
11、T载体直接连接载体直接连接（1）PCR产物两个产物两个3端一般都有一个端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在聚合酶的特性：在DNA双双链的链的3端再加上一个多余的核苷酸端再加上一个多余的核苷酸（优先加（优先加A）。）。（2）T载体的两个载体的两个3端人为地各加一个端人为地各加一个T利用利用Taq DNA聚合酶，当原料中只聚合酶，当原料中只有有dTTP时，被迫在平端载体上添加时，被迫在平端载体上添加T！四、四、DNA体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连
12、接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。决不能进行非粘性末端连接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切）用相同的酶切（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生都产生GATC4个碱基的粘性末端。个碱基的粘性末端。2.DNA插入的方向正确插入的方向正确用双酶切用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的开放阅读框（插入基因的开放阅读框（ORF）正确）正确（1）DNA定向插入定向插入（2）起始密码）起始密码
13、尤其当尤其当载体上有载体上有ATG起始密码的时起始密码的时候，更要注意。候，更要注意。ATGGAATTC载体载体ATGCGGAATTCT插入片断插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组重组但移码突变！但移码突变！4.防止载体自身环化连接防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的载体切口的5磷酸被除去，不能自我连磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。接。但可以与插入片断以单链连接。5 3 载体载体插入片断
14、插入片断1.载体自身环化连接载体自身环化连接2.载体之间互相连接载体之间互相连接3.插入片段互相连接插入片段互相连接4.一个载体与几个插入片段重组一个载体与几个插入片段重组五、载体和外源五、载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组几个载体与一个插入片段重组（能存活）（能存活）（能存活）（能存活）（不能存活）（不能存活）（能存活）（能存活）（能存活）（能存活）17黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性
15、末端连接又不易若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；定向克隆；(3)难插入特定的基因；难插入特定的基因；(4)再者就是大片段再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。1.目的目的增加受体菌细胞膜的通透性。增加受体菌细胞膜
16、的通透性。第二节第二节 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备感受态：处于能吸收周围环境感受态：处于能吸收周围环境中中DNA分子的生理状态的细分子的生理状态的细胞胞用用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理制备原理 该法是197年Mande和lHiga发现的，并且1972 Cohen 做实验进一步验证。其转化效率为每微克质粒DNA可以获得5106-2107的转化菌落。转化的可能原因为：转化的可能原因为：在0的CaCl2低渗溶液中，细菌细细菌细胞发生膨胀，同时胞发生膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液
17、晶结构，使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基酸酶的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细胞膜的外表磷酸钙复合物，并粘附在细胞膜的外表面上，当面上，当42 热击短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶热击短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。4.制备过程制备过程培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至On ice 5-10 min4离
18、心离心收集菌收集菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心离心收集菌收集菌4离心离心收集菌收集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬二、重组二、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌（1）转化（）转化（transformation)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（2）转染（）转染（transfection)大肠杆菌捕获裸露的大肠杆菌捕获裸露的噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。1.外源外源DNA导入细菌的几种方法导入细菌的几种方法（3）转导（）转导（transduct
19、ion)借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。每每 gDNA转化成功的细菌克隆数。转化成功的细菌克隆数。3.转化方法转化方法 2.转化率转化率简单简单，但转化效率不高（，但转化效率不高（106-108/gDNA）。）。（1）热休克法（）热休克法（heat shock）转化效率高（高于转化效率高（高于109/gDNA）。）。（2）电转化法）电转化法DNA分子转化受体菌获得转化子的效率10ng载载体体DNA100 L感感受态菌受态菌 On ice混混合，静置合，静置10分钟分钟42C 1分钟分钟加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇1小时小时10-100 L转化转
20、化液涂含抗菌素液涂含抗菌素的平板的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热休克法）热休克法LB培养受体菌至培养受体菌至OD600冰浴冰浴15分钟，分钟，2C离心集菌离心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离心离心集菌集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离心离心收集菌体收集菌体少量冰冷少量冰冷的水重悬的水重悬分装成分装成 50-300 L 电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质质粒粒DNA On ice混合混合加入加入1mLSOC培养液培养液37C中速震中速震荡荡60分钟分钟10-100 L转化液涂转化液涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板转
21、化转化（2）电转化法）电转化法 电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等成功的用于大肠杆菌的转化。其原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞其原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促使外膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促使外源源DNA的有效吸收。的有效吸收。电穿孔转化的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA的浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每微克DNA可以得到1091010转化子。电压增大或脉冲时间延长均将提高转化效率，但受体细胞的存活率降低。4.平板培养平板培养基培养细菌基培养细菌10-100 L转转化液化液涂于
22、含抗涂于含抗菌素的平菌素的平板板37过夜过夜环形重组质粒环形重组质粒 质粒自我连接质粒自我连接线性载体或线性载体或DNADNA片断进入细菌会被降解。片断进入细菌会被降解。环形质粒数环形质粒数（1）重组质粒）重组质粒 5.影响转化率的因素影响转化率的因素生长状态生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下以下CaCl2处理处理使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。
23、融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞）感受态细胞 （competent cells)转化率高的菌株；转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节第三节 外源基因导入真核细胞外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择菌株选择如：如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31（1）利用原生质球进行转化）利用原生质球进行转化 2.酵母的转化方法酵母的转化方法 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2
24、、PEG插入外源基因插入外源基因 的酵母载体的酵母载体CaCl2使使细胞膜细胞膜具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。转化转化 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000（2）利用）利用Li+盐进行转化盐进行转化PEG（聚乙二醇）使（聚乙二醇）使细胞壁细胞壁具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入，还可使细胞膜之间以及细胞膜与进入，还可使细胞膜之间以及细胞膜与DNA之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡看护培养
25、基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗二、导入植物细胞二、导入植物细胞1.叶盘法（叶盘法（leaf disk)植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入电混合入电击缓冲液击缓冲液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化2.电击法（电击法（electroporation)又称高速微型子弹射击法（又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨或金弹头钨或金弹头 吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞的现象，将包裹在金属颗粒表面
26、的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基因转化方法DNA颗粒载体的制备：用cacl2沉淀DNA以及用亚精胺、聚乙二醇的黏附作用进行的其它几种方法其它几种方法花粉管介导法花粉管介导法种子浸泡法种子浸泡法-种子吸水时将外源基因携入种子胚中穗鞘腔浸泡法穗鞘腔浸泡法-迫使卵母细胞吸收外源DNA脂质体转化外源基因脂质体转化外源基因-通过胞融合或胞吞作用超声波处理法超声波处理法激光以及激光以及PEG法等等法等等（1）原理：）原理：三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水缓冲盐水(羟乙基哌嗪磺酸羟乙基哌嗪磺酸)与含有氯与含有氯化钙和化钙和DNA的溶液缓慢混合，会
27、形成的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和含磷酸钙和DNA的沉淀。的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多依据不同的细胞类型，平皿上最多能有能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。1973年 Graham F.L.不需要载体。不需要载体。（2）特点：）特点：1、将待转染的外源DNA同cacl2 混合制成cacl2 DNA溶液2、在不断搅拌过程中，逐滴加入磷酸钙溶液，形成磷酸钙和DNA共沉淀3、然后，直接用吸管仔细转移共沉淀，使之粘附到培养的哺乳动物单层细胞表面，就会迅速地被细胞捕获。据报道，添加甘油或二甲基亚砜会增加某些细胞吸收外源DNA的数量脂质体有商业试剂盒（如脂质体有商业试剂盒（如L
28、ife Technologies）。）。2.脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。脂质体是一种人造的脂质小泡，外周是脂双层，内部是水腔。内部水腔双层膜我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。1.细胞的状态细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形
29、态都会发生变化了。2.细胞的融合度。细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍（我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高）。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。4.加入无血清培养基后56小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训！5.转染的质粒一定纯度好转染的质粒一定纯
30、度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。直接把外源直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。使其整合到染色体上。3.显微注射法显微注射法(microinjection)二乙氨乙基（二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡）葡聚糖简称聚糖简称DEAE-葡聚糖葡聚糖它是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动它是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡聚糖传染法葡聚糖传染法吸附到细胞表面后被
31、细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNADNA可可以进入到细胞核里。以进入到细胞核里。其机理可能是（1）DEAE-葡聚糖同葡聚糖同DNA结结合成复合物，可以保护合成复合物，可以保护DNA免受合算酶免受合算酶的降解作用；（的降解作用；（2）DEAE-葡聚糖可以葡聚糖可以同细胞膜发生作用，从而使同细胞膜发生作用，从而使DNA能够容能够容易地穿过细胞表面进入细胞内部易地穿过细胞表面进入细胞内部DEAE-dextran细胞细胞外源外源DNA预处理预处理摄入摄入DEAE-dextran外源外源DNA细胞细胞混合混合DEAE-dextran对细胞有毒对细胞有毒!外源基因外源基因导入细胞导入细胞的方法的方法18