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1、电针对脊髓损伤后神经保护作用的可能机制探析,SCI医学论文摘 要： 目的:观察不同配穴电针方式对脊髓损伤 (SCI) 大鼠IL-l , IL-6及IL-10表示出的影响, 讨论电针在脊髓损伤修复经过中的作用机制。方式方法:48只SD大鼠随机分为4组:假手术组 (12例) 、对照组 (12例) 、夹脊电针组 (12例) 、督脉电针组 (12例) 。术后第7天对各组大鼠进行BBB运动功能评分, 并采用苏木精-伊红及Nissle染色观察组织细胞形态变化, 采用实时荧光定量PCR法检测白介素-l (ILl ) , 白介素-6 (IL-6) 和白介素-10 (IL-10) mRNA的表示出情况。结果:术
2、后第7天对照组、夹脊电针组、督脉电针组BBB评分均低于假手术组 (P 0.05) , 夹脊电针组、督脉电针组BBB评分均高于对照组 (P 0.05) ;对照组、夹脊电针组、督脉电针组IL-l , IL-6及IL-10mRNA的表示出含量均高于假手术组 (P 0.05) ;夹脊电针组、督脉电针组IL-l , IL-6mRNA的表示出含量均低于对照组 (P 0.05) ;夹脊电针组、督脉电针组IL-10mRNA的表示出含量均高于对照组 (P 0.05) ;夹脊电针组与督脉电针组IL-l , IL-6及IL-10mRNA的表示出差异无统计学意义 (P 0.05) 。结论:夹脊、督脉电针均能够改善大鼠
3、SCI后下肢运动功能, 降低IL-l 和IL-6的表示出, 增加IL-10的表示出, 抑制SCI后炎症反响。 本文关键词语： 脊髓损伤; 电针; 白介素-l 白介素-6; 白介素-10; Abstract： Objective:To observe the effect of electroacupuncture treatment (EA) at different acupoints on the expression of IL-1 , IL-6 and IL-10 in rats with spinal cord injury (SCI) and discuss the role an
4、d mechanism of electroacupuncture in the repair process of spinal cord injury.Methods:A total of 48 SD rats were randomly divided into 4 groups:sham operation group (n=12) , control group (n=12) , Jiaji EA group (n=12) , and Du Meridian EA group (n=12) .Scores of Basso Beattie Bresnahan (BBB) motor
5、functions were assessed at 7 th days after operation.Histopathological changes were observed by HE and Nissle staining.The expressions of IL-1 , IL-6 and IL-10 mRNA were detected by quantitative real time-PCR (qRT-PCR) .Results:The BBB scores of the control group, Jiaji EA group, and Du meridians EA
6、 group were lower than the sham operation group on the 7 th day after operation (P 0.05) .The BBB scores of Jiaji EA group and Du meridians EA group were higher than the control group (P 0.05) .The expression levels of IL-1 , IL-6 and IL-10 mRNA in the control group, Jiaji EA group and Du meridians
7、EA group were higher than those in the sham operation group (P 0.05) .The expression levels of IL-1 and IL-6 mRNA in the Jiaji EA group and Du meridian EA group were lower than those in the control group (P 0.05) .The expression levels of IL-10 mRNA in Jiaji EA group and Du meridians EA group were h
8、igh than those in the control group (P 0.05) .The expressions of IL-1 , IL-6 and IL-10 mRNA in Jiaji EA group and Du meridian EA group had no statistical significance (P 0.05) .Conclusion:Jiaji and Du Meridian EA could improve the motor function of the SD rats lower limb, reduce the expression of IL
9、-1 and IL-6 and increase expression of IL-10 and inhibit the inflammatory response after SCI. Keyword： spinal cord injury; electroacupuncture; interleukin-1 interleukin-6; interleukin-10; 脊髓损伤 (Spinal Cord Injury, SCI) 病情严重复杂, 预后差, 易造成终生残疾或危及生命。脊髓损伤包括原发性损伤阶段和继发性损伤阶段, 炎症反响在调节脊髓损伤的发生机制中起核心作用, 是继发性损伤阶段
10、的重要组成部分1。减轻脊髓损伤后早期炎症反响, 可抑制继发性损伤, 并促进脊髓神经机能恢复2,3。针灸是中国传统医学的重要组成部分, 华而不实电针治疗, 针刺同时结合低频直流电, 在临床中可应用于很多疾病的治疗。研究发现, 电针可促进神经系统疾病的神经功能恢复4,5。本实验建立大鼠急性脊髓损伤模型, 分别电针夹脊、督脉穴对其进行治疗, 观察脊髓组织细胞形态变化, 检测IL-I , IL-6和IL-10mRNA表示出的变化, 以及脊髓损伤后大鼠运动功能变化, 讨论电针对脊髓损伤后神经保卫作用的可能机制, 并分析不同配穴电针方式对大鼠脊髓损伤的影响差异。 1、 材料与方式方法 1.1、 实验动物
11、雄性、清洁级SD大鼠48只, 体质量180220g, 中位数208g, 购自温州医科大学实验动物中心, 实验动物许可证号SYXK (浙) 2018-0150, 于温度2025, 湿度42%50%中分笼饲养。 1.2、 实验试剂 Harris苏木素液 (北京中杉金桥生物技术有限公司) , 尼氏染色液, Trizol Reagent (invitrogen公司) , Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司) 。 1.3、 实验仪器 MASCIS Impactor (NYU, USA) , 韩氏穴位神经刺激仪 (南京济生医疗科技有限公
12、司) , LightCycler实时荧光定量PCR (美国Roche公司) , 薄壁无裙边96孔板 (矮管) (汉爵克斯贸易 (上海) 有限公司) , 680型全自动酶标仪 (美国Bio-Rad公司) 。 1.4、 方式方法 1.4.1、 模型制备 SD大鼠腹腔注射5%水合氯醛7mL/kg, 麻醉后以T10为中心, 正中切开皮肤, 咬除T9T11棘突及全部椎板, 暴露T10脊髓, 保持硬脊膜完好, 使用NYU Impactor精到准确撞击6, 制作大鼠SCI中度损伤 (T10, 10g, 25mm) 模型。模型成功标准:1) 双下肢及躯体回缩扑动;2) 大鼠尾巴痉挛摆动;3) 双下肢延迟缓慢性
13、瘫痪。术后第13天予青霉素腹腔注射 (0.2 mL/kg) 预防感染, 术后人工协助排尿3次/d. 1.4.2、 动物分组及治疗方式方法 48只大鼠随机分为假手术组、对照组、夹脊电针组、督脉电针组, 每组12只。假手术组只打开椎板, 无脊髓损伤及电针治疗;对照组SCI后不予以电针治疗;夹脊电针组SCI后, 电针于损伤脊髓节段上下两对夹脊穴;督脉电针组SCI后, 电针于损伤脊髓节段上下两个督脉穴。电针组均于打击损伤成功后30 min内进行初次电针治疗, 持续30min, 1次/d, 总共电针7d.电针治疗仪参数:采用连续脉冲, 频率2Hz, 输出电流0.61.0mA, 以大鼠针刺部位出现轻度跳动
14、且大鼠无明显挣扎为准 (见图1) 。 图1 电针刺激示意图 1.4.3、 BBB运动功能评分评价大鼠SCI后下肢运动功能变化 各组分别于术前及术后第7天行BBB (Basso, Beattie and Bresnahan) 评分, 最低分0分, 最高分21分。每次评分均采用双人、双盲独立观察记录, 最后取平均值。 1.4.4、 苏木精-伊红及Nissle染色 大鼠术后第7天取损伤中心脊髓, 4%多聚甲醛中4浸过夜、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片。按苏木精-伊红及Nissle试剂盒讲明书进行操作, 光学显微镜下观察损伤脊髓组织细胞形态变化。 1.4.5、 实时荧光定量PCR法测定IL-
15、l , IL-6及IL-10mRNA表示出 大鼠术后第7天以损伤区为中心取5mm脊髓至-80超低温冰箱保存。根据讲明书, Trizol法提取总RNA, 测定浓度后取1 g RNA, 根据TaKaRa公司逆转录试剂盒 (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit) 讲明书逆转录合成cDNA.参考TaKaRa公司荧光实时定量PCR试剂盒 (SYBR?Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time) ) 讲明书行实时荧光定量PCR反响, GAPDH为内参照基因。所有标本均被重复检测3次。分析融链曲线, 用CT值比拟法来计算损伤脊髓组织内I
16、L-l , IL-6及IL-10mRNA的相对表示出量。 1.5、 统计学方式方法 采用SPSS18.0统计学软件进行数据分析, 计量资料用 s表示, 多组间比拟运用单因素方差分析, 两两比拟采用LSD-t检验, 方差齐性检验采用Levene检验。P 0.05差异有统计学意义。 2、 结果 2.1、 后肢BBB运动功能评分比拟 术前各组大鼠BBB评分均为21分, 术后第7天对照组、夹脊电针组、督脉电针组BBB评分降低, 均低于假手术组, 差异有统计学意义 (P 0.05) ;夹脊电针组、督脉电针组BBB评分均高于对照组, 差异有统计学意义 (P 0.05) 。夹脊电针组与督脉电针组差异无统计学
17、意义, 见表1. 表1 术后第7天BBB运动功能评分比拟 ( s) 注:1) 与假手术组比拟, P值分别为 0.01 (对照组) 、 0.01 (夹脊电针组) , 0.01 (督脉电针组) ;2) 与对照组比拟, P值分别为 0.01 (夹脊电针组) , 0.01 (督脉电针组) ;3) 与夹脊电针组比拟, P值为0.844 (督脉电针组) , P 0.05. 2.2、 电针后脊髄苏木精-伊红染色病理变化 光镜下观察假手术组脊髓构造完好, 灰白质边界清楚。可见前角运动神经元细胞类圆形, 胞浆丰富, 边界清楚明晰, 周围有较多的中小型神经细胞及胶质细胞 (见图2A) 。对照组可见脊髓构造毁坏,
18、灰质中可见缺损区, 大量神经元核固缩 (见图2B) 。夹脊电针组 (见图2C) 和督脉电针组 (见图2D) , 神经元的损伤范围介于假手术组和对照组之间;脊髓构造欠清楚明晰, 出血、坏死和周边组织水肿较对照组轻, 神经元残留, 但染色模糊, 构造不清。 图2 电针后脊髄苏木精-伊红染色病理变化 (50 ) 2.3、 电针后脊髄Nissle染色病理变化 光镜下可见:假手术组可见尼氏体神经细胞经甲苯胺蓝染色后呈浓密的篮色颗粒完好构造, 神经元细胞数目多 (见图3A) 。对照组可见尼氏体神经元数量显着降低, 神经元形态显示不规则, 甲苯胺蓝染色也显着变浅, 色泽昏暗 (见图3B) 。在夹脊电针组 (
19、见图3C) 和督脉电针组 (见图3D) , 均可见神经元数量介于假手术组和对照组之间, 细胞质呈染色较浅的颗粒状形态。 图3 电针后脊髄Nissle染色病理变化 (50 ) 2.4、 电针后脊髓IL-l , IL-6及IL-10mRNA的表示出 实时荧光定量PCR定量显示, 造模7d后假手术组、对照组、夹脊电针组及督脉电针组IL-l mRNA的相对表示出含量分别为1.59 0.90, 6.43 1.02, 4.60 0.34及4.71 0.36;IL-6mRNA的相对表示出含量分别为0.58 0.06, 5.68 0.32, 3.73 0.32及4.30 0.21;IL-10mRNA的相对表示
20、出含量分别为0.57 0.18, 2.92 0.44, 3.48 0.59及3.48 0.59.对照组、夹脊电针组、督脉电针组IL-l , IL-6及IL-10mRNA的表示出含量均高于假手术组, 差异有统计学意义 (P 0.05) ;夹脊电针组、督脉电针组IL-l 和IL-6mRNA的表示出含量均低于对照组, 差异有统计学意义 (P 0.05) ;夹脊电针组、督脉电针组IL-10mRNA的表示出含量均高于对照组, 差异有统计学意义 (P 0.05) ;夹脊电针组与督脉电针组受损伤脊髓组织中IL-l , IL-6及IL-10mRNA表示出比拟无统计学意义 (P 0.05) , 见图4. 图4
21、电针后脊髓IL-l , IL-6及IL-10mRNA相对表示出量 3、 讨论 众所周知, 过度炎症反响将会导致严重的脊髓继发性损伤, 加剧脊髓组织损伤及神经元细胞的凋亡, 影响SCI后神经的修复和功能的改善。IL-1 是一种具有多种生物学功能的炎性细胞因子, SCI后IL-1 表示出升高, 启动凋亡基因表示出, 诱导细胞凋亡, 引起细胞水肿, 加重炎症反响7,8。IL-6可在内毒素、IL-1 和TNF- 刺激下由多种细胞反响产生, 可诱导硫酸软骨素蛋白多糖表示出上调, 促进胶质瘢痕的构成, 抑制轴突生长9。IL-10是一种抗炎细胞因子, 具有免疫调节作用, 其上调能抑制IL-1 , IL-6及
22、TNF- 等炎症因子的过度表示出和释放10。在中枢神经系统中, 太多炎症介质的产生可能导致细胞水肿, 细胞代谢应激及组织坏死11。因而, 采取各种措施防止或抑制炎症的经过已经成为SCI治疗的关键手段之一。 已有研究表示清楚, 针刺治疗能够改善SCI后脊髓供血, 抑制神经细胞凋亡, 促进神经功能恢复12,13。电针具有针刺和电刺激双重成效, 其治疗SCI的机理愈加复杂, 本实验选取电针夹脊穴及督脉穴, 考虑夹脊及督脉穴分别属于节段叠加配穴范畴和中轴贯穿配穴范畴14, 对上述穴位进行有效针刺并加以电刺激, 能够疏通督脉, 振奋阳气, 到达阴阳调和的作用。脊髓损伤伴随着炎症反响的发生, 而Yang等
23、研究15,16表示清楚, 电针治疗具有抑制炎症、减轻细胞受损、抗凋亡及镇痛等作用。本研究发现, SCI后大鼠IL-l , IL-6及IL-10表示出明显增高, 经电针夹脊、督脉穴治疗后均可明显降低脊髓损伤组织中IL-l 和IL-6的浓度, 升高IL-10的表示出, 提示脊髓损伤后电针夹脊、督脉穴通过减少脊髓组织炎性细胞因子IL-l 和IL-6生成, 增加抗炎细胞因子IL-10的表示出, 减轻脊髓神经组织的炎症反响, 进而可能促进受损神经的恢复或延缓继发性损害, 具有神经保卫作用。除此之外, 本研究结果发现, 夹脊电针组与督脉电针组受损伤脊髓组织中IL-l , IL-6及IL-10mRNA表示出
24、差异无统计学意义, 提示电针夹脊和电针督脉治疗SCI的炎症反响的效果无明显差异。 脊髓损伤是一个多系统的复杂经过, 在以后的实验研究中, 需要进一步研究针灸详细可靠的作用机制, 为临床治疗提供有效的实验根据。 以下为参考文献： 1Anwar MA, Shehabi TSA, Eid AH.Inflammogenesis of secondary spinal cord injuryJ.Frontiers in Cellular Neuroscience, 2021, 10 (98) :1-24. 2Mao X, Miao G, Tao X, et al.Saikosaponin a prote
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