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1、miR-125a和miR-206在乳腺癌及其癌旁组织的表达情况,肿瘤学论文乳腺癌是全球发病率最高的女性恶性肿瘤，早期发现乳腺癌并准确分析其分子生物学特点对预后有重要意义。微小 NA( microNA，mi) 是一种长度约 18 25 个核苷酸、进化上高度保守的非编码单链小 NA，通过与靶标 mNA 结合，抑制相关 mNA 翻译，诱导相关 mNA 降解，使目的蛋白表示出水平发生变化。一些 miNA 具有类似癌基因或抑癌基因功能，在乳腺癌侵袭、发展中发挥重要作用1。mi-125a 和 mi-206 被以为具有类似抑癌基因的功能，Tavazoie 等2发现 mi-206 在高转移性乳腺癌细胞株中表示
2、出下调，在细胞中上调mi-206 的表示出，细胞的侵袭、转移能力显着下降。 Scott GK 等3发现，mi-125a 可通过靶向作用于人类表皮生长因子受体 2( HE-2) 和 HE-3 m-NA 下调 HE-2 和 HE-3 蛋白质表示出水平，抑制了乳腺癌细胞的迁移和侵袭。当前 mi-125a 和mi-206 与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系还不明确，它们介入乳腺癌发生发展的详细机制仍然存在争议。因而，本研究通过探寻求索 mi-125a 和mi-206 在乳腺癌及其癌旁组织的表示出情况，分析它们与乳腺癌患者临床病理特征之间的相关性。 1 材料与方式方法 1. 1 一般资料 收集 2020
3、 年 1 月 1 日 2020 年 12 月 1 日手术切除并经病理学证实为浸润性导管癌的女性乳腺癌患者 35 例，42 62 岁，中位年龄 51 岁，具有完好的临床病理学资料，行乳腺癌改进根治术或保存乳腺癌根治术，肿瘤直径 1. 6 4. 5 cm( 平均2. 2 cm) ，术中在无菌条件下留取癌组织以及距离癌边缘 3 cm 癌旁腺体组织。标本获取后立即用无 NA 酶的 0. 9% NaCl 冲洗，NA 酶抑制剂处理，4 过夜，置 80 冰箱内保存。患者术前均未接受任何治疗( 新辅助化疗及内分泌治疗) ，组织学分类均参考 NCCN 2020 年指南进行。在取材前，所有患者均签署了知情同意书，
4、本研究得到了伦理委员会批准。 1. 2 方式方法 1. 2. 1 试剂 Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司，M-MLV 逆转录酶、NA 酶抑制剂、oligo dT、dNTPs、KOD-plus、SYB Mastermix 等 购 自 日 本Takara 公司，引物由上海生工合成。乳腺癌 HE-2 / neu( 17q12) / TOP 2A ( 17q21 ) / CSP17 多色检测试剂盒购自广州安必平医药科技有限公司。 1. 2. 2 mi-125、mi-206 检测 将所获得的 50 100 mg 新鲜组织，提取总 NA，用 500 ng 总 NA分别以 miNA 茎
5、环反转录( reverse trasnscription，T) 引物进行逆转录，反响条件为 10 L 体系，16 30 min，42 15 min，85 5 s; 以 20 L 反响体系进行实时定量 PC ( real-time polymerasechain reaction，eal-time PC) ，相关引物系列见表1。miNA 检测反响体系包括 1 L T 产物、1 SYB Green I Mastermix、0. 5 Ixmol / L miNA 特异前向引物、0. 5 Ixmol/L 通用的反向引物。eal-timePC 条件为: 95 10 min，95 15 s，60 1 mi
6、n，40个循环。PC 产物经 8%聚丙酰胺凝胶电泳分析，记录每个反响管中的 eal-time PC 荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即 Ct 值。以 U6作为内参，分析 miNA 的表示出，表 1 为相关引物序列，采用定量 PC 中的相对定量法，以 2 Ct表示肿瘤组织目的基因的表示出相对于配对的癌旁组织的倍数变化，华而不实Ct = ( Ct miNA Ct U6) 肿瘤组织 ( Ct miNA Ct U6) 癌旁组织。 1. 2. 3 雌激素受体和孕激素受体 肿瘤标本经石蜡包埋处理切片 4 m，采用免疫组化 SP 法，检测雌激素受体( estrogen receptor，E) 和孕激
7、素受体( progesterone receptor，P) 的表示出。结果判定: E和 P 蛋白表示出以胞质内出现弥漫的棕黄色颗粒为阳性。染色强度评分: 0 分为未着色，1 分为弱染呈淡黄色，2 分为中度染色呈黄色，3 分为强染呈棕黄色，4 分为很强呈褐色。观察高倍视野( 400 ) 计数 100 个细胞中阳性细胞所占百分比，0 分为阴性，1 分为阳性细胞 25%，2 分为 25% 50% ，3 分为 50% 75% ，4 分为 75% 。染色强度与阳性细胞的分值相加，0 分为阴性( ) ，1 4分为弱阳性( + ) ，5 8 分为强阳性( + + ) ，弱阳性也归为阴性表示出，强阳性定义为阳
8、性表示出。 1. 2. 4 HE-2 和 DNA 拓扑异构酶 2A( TOP 2A)的表示出 荧光原位杂交法( FISH) 检测肿瘤标本切片厚 4 m。显微镜下计数: 在清楚明晰的肿瘤区域，在60 个核内计数位点特异探针 ( GSP ) HE-2 ( 红色) 、GSP TOP 2A( 绿色) 和 CSP17( CSP 指着丝粒探针) ( 青色) 信号，分别记录 GSP HE-2、GSP TOP2A 和 CSP17 的信号总数、GSP HE-2 与 CSP 17 比值及 GSP TOP 2A 与 CSP17 比值。HE-2、TOP 2A结果断定标准: ( 1) GSP HE-2、TOP 2A(
9、红色、绿色) 分别出现诸多信号连接成簇; ( 2) GSP HE-2、TOP 2A / CSP17 ( 红色、绿色 / 青色) 比值分别 2. 2、2; ( 3) GSP HE-2、TOP 2A / CSP17 ( 红色、绿色/青色) 比值分别 1. 8、0. 8; ( 4) GSP HE-2、TOP 2A CSP17 ( 红色、绿色 / 青色) 的比值分别为1. 8 2. 2、0. 8 2. 04。若知足情况( 1) 或( 2) ，断定为 HE-2、TOP 2A 基因扩增; 若知足情况( 3) ，断定为 HE-2、TOP 2A 基因无扩增; 若知足情况( 4) ，需要再计数 20 个细胞核中
10、的信号，或由另一位实验人员重新计数，如仍为临界值，则应在检测报告中注明，假设在计数区域存在信号弱或高背景情况，有可能干扰到信号判定，应再拿一张组织切片重新进行实验。 1. 3 统计学方式方法 采用 SPSS 13 0 统计软件对表示出差异进行分析，因本研究样本例数较少，得出数据非正态分布，miNA 的表示出数据均以中位数和四分位间距M( IQ) 表示。配对设计资料采用非参数 Wilcoxon符号秩检验，两组之间比拟采用 Mann-Whitney U检验，P 0. 05 为差异具有统计学意义。 2 结果 2. 1 mi-125a、mi-206 表示出 35 例乳腺癌中，mi-125a 的相对表示
11、出量为0. 02 3. 97，华而不实 28 例( 80% ) mi-125a 的相对表示出量小于1，7 例( 20%) 大于1，四分位间距为0. 57 0. 97，中位数为 0. 79，采用配对样本 Wilcoxon 符号秩检验，癌组织与癌旁组织 mi-125a 表示出量差异具有统计学意义( P 0. 05) 。mi-206 的相对表示出量范围是 0. 06 1. 82，35 例乳腺癌中，30 例( 86%) mi-206 的相对表示出量小于 1，5 例( 14%)大于1，四分位间距为0. 64 0. 92，中位数为0. 85，采用配对样本 Wilcoxon 符号秩检验，癌组织与癌旁组织 m
12、i-125a 表示出量差异具有统计学意义( P 0. 05) 。 2. 2 HE-2、TOP 2A 表示出 35 例乳腺癌患者中，HE-2 基因扩增 16 例( 45. 7%) ，表现为多点状红色或成簇红色; Top2A基因扩增 18 例( 51. 4%) ，表现为多点状绿色或成簇绿色。HE-2、TOP 2A 阴性主要表现为 17 号染色体特异信号呈单一青色或缺失。见图 1。 2. 3 mi-125a、mi-206 与乳腺癌临床病理的关系 mi-125a 的高表示出与乳腺癌患者的淋逢迎阴性、HE-2 阴性及 TOP 2A 阴性患者具有相关性( P 0. 05 ) ，与肿块大小、年龄、月经状态、
13、E 状态、P 状态无关。mi-206 的高表示出与相对小的肿瘤体积、E 阴性、P 阴性及 HE-2 阴性具有相关性( P 0. 05) ，与乳腺癌患者的年龄、月经状态、淋逢迎转移情况以及 TOP 2A 的表示出程度无关。见表2。 3 讨论 研究已证实 mi 的表示出变化与多种人类恶性肿瘤的发生及发展相关，但是它们的调控机制复杂，调控目的蛋白多样，因而，mi 功能探寻求索仍然是一个较为复杂的难题。成熟 mi-125a( hsa-mir-125a) 位于染色体 19q13. 41，包含处于同一前体的2 条 mi ( mi-125a. 5p 和 mi-125a. 3p) ，与线虫的 lin-4 同源
14、。Li 等5的研究发现 mi-125a 在乳腺癌中能够发生种系突变，并与乳腺癌的发生发展相 关，其 可 能 突 变 的 位 点 包 括 rs10404453、rs12975333 和 rs143525573 三个扩增片段。mi-125a 还直接下调 CEBB2、NA 结合蛋白、Hu、ho 激酶-1、锌指蛋白 KLF13 和神经母细胞瘤相关AID3B 等基因的 mNA 和蛋白的水平，发挥肿瘤抑制作用2，6 9。 mi-206 定位于人染色体 6p12. 2，被以为是骨骼肌和心肌相关的 mi，通过下调 DNA 聚合酶的P180 亚基和肌转录因子促进肌肉分化10。随后发现 mi-206 在多种人类恶
15、性肿瘤中均表示出下调，最近的研究发现其与乳腺癌的关系密切，主要通过下调 E 以及 E 共调节蛋白的 mNA 和蛋白表示出，依靠 EGF/MAPK 途径抑制乳腺癌细胞增殖11 12。mi-206 还 直 接 作 用 于 Notch3、cy-clinD2、Cdc42 等 蛋 白，抑 制 癌 细 胞 的 侵 袭、转移13 15，近期 SNP 研究发现 mi-206 在 rs6920648位点发生突变，并与乳腺癌发生相关16。 在本实验中，乳腺癌患者肿瘤组织中 mi-125a 和 mi-206 的相对表示出量明显低于癌旁组织，结合文献乳腺癌患者血清中 mi-125a 和 mi-206 浓度亦明显低于健
16、康女性血清中的表示出，提示它们有潜力能够作为乳腺癌肿瘤标记物，用于乳腺癌的早期诊断17。本研究结果显示，mi-125a 与淋逢迎转移呈负相关，mi-206 与肿块大小呈负相关，提示 mi-125a、mi-206 可能作为抑癌基因，对乳腺癌的发展起到抑制作用，此结果与之前文献报道一致5，18。当前临床上基于乳腺癌的 E、P 及HE-2 表示出情况将乳腺癌分为三型( 激素受体阳性型、HE-2 阳性型、三阴性型) ，对评价乳腺癌预后、选择个体化治疗方案有重要的意义。HE-2阳性的乳腺癌恶性程度较高，术后容易复发及转移，赫赛汀靶向治疗是其治疗的重大进展之一。本研究中 mi-125a 的高表示出与 HE
17、-2 阴性表示出具有相关性，提示 mi-125a 可能对 HE-2 的表示出具有调节作用，mi-125a 已被证明能够直接抑制HE-2 和 HE-3 的表示出3。mi-125a 在接受恩替诺特治疗的 HE-2 阳性乳腺癌患者中表示出上调，这种表示出上调作用是恩替诺特发挥作用的重要机制，所以 mi -125a 对于开发新的抗 HE-2 药物和克制赫塞汀耐药有重要意义19。TOP 2A 高表示出的乳腺癌有更具侵袭性的生物学行为，在蒽环类单药或蒽环类联合化疗中可获得较好疗效。在本研究中，mi-125a 在 TOP 2A 阴性患者中的表示出水平高于阳性患者，提示 mi-125a 可能调节 TOP2A
18、基因。 三阴性乳腺癌是具有恶性程度高、易复发、易转移、治疗手段少等特点。国内赵晓艾等20用mis 芯片技术对三阴性乳腺癌 miNA 差异表示出谱进行研究，挑选获得 17 个相关 mi，显着上调的有 mi-93、mi-328，显着下调的有 mi-145、mi-20。本研究中，mi-206 高表示出与乳腺癌的 E 阴性、P 阴性、HE-2 阴性相关，提示 mi-206 可能与三阴性乳腺癌存在相关性，Tavazoie 等2在体外细胞实验中，将 mi-206 导入转移性乳腺癌细胞株，能够有效抑制乳腺癌细胞的侵袭转移，所以mi-206 有望成为三阴性乳腺癌治疗的新靶点。 除对三阴性乳腺癌抑制外，mi-2
19、06 对 E 阳性细胞株也有较高的抑制作用，当前以为 mi-206 是乳腺癌从管腔-A 型转化为基地样型的开关，并且可能逆转管腔-A 型转化为基地样型21。所以 mi-206 对于乳腺癌的治疗有重要意义。 总之，mi-125a 和 mi-206 有望作为一种新的肿瘤标志物用于乳腺癌的诊断和预后判定，对于HE-2 阳性和三阴性乳腺癌的治疗具有重要意义，但其具体的作用机制以及能否成为真正临床治疗靶向位点，有待于进一步的研究。 4 以下为参考文献 1李志华，罗永辉 miNA 与乳腺癌转移J 国际外科学杂志，2018( 1) : 46 48 2Tavazoie SF，Alarc n C，Oskarss
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