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1、第二章第二章 预处理技术预处理技术2.5 离心技术离心技术2.1 概述概述2.2 发酵液过滤特性的改变与相对纯化发酵液过滤特性的改变与相对纯化2.3 絮凝与凝聚絮凝与凝聚2.4 细胞破碎细胞破碎2.1 2.1 概述概述生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤：生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤：动物组织和器官动物组织和器官要先除去结缔组织、脂要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，然后绞碎，选择适当的肪等非活性部分，然后绞碎，选择适当的溶剂形成细胞悬液。溶剂形成细胞悬液。植物组织和器官植物组织和器官要先去壳、除脂，再粉碎，要先去壳、除脂，再粉碎，选择适当的溶剂形成细胞悬液。选择适当的溶剂形成细胞
2、悬液。发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及制成的细胞制成的细胞悬液悬液等则根据目标产物所处位等则根据目标产物所处位置不同进行相应的处理。置不同进行相应的处理。发酵液预处理的目的和内容发酵液预处理的目的和内容 相对纯化。相对纯化。发酵液预处理的主要目的发酵液预处理的主要目的：*发酵液预处理的主要包括发酵液预处理的主要包括：改变发酵液改变发酵液(培养液培养液)的物理性质，以利的物理性质，以利于固液分离。主要方法有加热、调整于固液分离。主要方法有加热、调整pH、凝聚和絮凝。、凝聚和絮凝。去除发酵液去除发酵液(培养液培养液)中部分杂质，以利于中部分杂质，以利于提取和精制
3、后继各工序的顺利进行。提取和精制后继各工序的顺利进行。发酵液过滤特性的改变；发酵液过滤特性的改变；2.1 2.1 发酵液过滤特性的发酵液过滤特性的 改变与相对纯化改变与相对纯化这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难微生物发酵液的特性为：微生物发酵液的特性为：发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水；发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧性质不稳定，
4、随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响成分复杂，杂质较多。成分复杂，杂质较多。一、改善发酵液过滤特性的方法：一、改善发酵液过滤特性的方法：1.降低液体黏度降低液体黏度2.调整调整pH3.加入反应剂加入反应剂4.加入助滤剂加入助滤剂5.凝聚凝聚6.絮凝絮凝 常用的方法有加水稀释法和常用的方法有加水稀释法和加热法加热法。加水。加水稀释法会加大后续过程的处理任务。稀释法会加大后续过程的处理任务。1.降低液体黏度降低液体黏度注意事注意事项：严格控制加格控制加热温度与温度与时间。首先，。首先，加加热的温度必的温度必须控制在不影响目的控制在不影
5、响目的产物活性物活性变质的范的范围内；其次，温度内；其次，温度过高或高或时间过长，会使会使细胞溶解，胞内物胞溶解，胞内物质外溢，增加外溢，增加发酵液酵液的复的复杂性，影响其后的性，影响其后的产物分离与物分离与纯化。化。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一，方法简单有效、成本低廉。法之一，方法简单有效、成本低廉。如利用酸碱性来如利用酸碱性来调节调节pH值使蛋白质等两性物值使蛋白质等两性物质达到等电点质达到等电点得以除去。又如过滤中，发酵得以除去。又如过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整整pH值改变
6、易吸附分子的电荷性质，即可减值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。少堵塞和污染。2.调整调整pH3.加入反应剂加入反应剂加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀生成不溶性沉淀，如，如CaSO4、AlPO4等。等。生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶体物和悬浮物凝固，从而改善过且能使胶体物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。滤性能。助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量对过滤速度影响很大。对过滤速度影
7、响很大。4.加入助滤剂加入助滤剂助滤剂是一种助滤剂是一种不可压缩不可压缩的的多孔多孔微粒，它能微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。使滤饼疏松，滤速增大。常有的助滤剂有常有的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液，也可两种方法同时使用。发酵液，也可两种方法同时使用。在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的在采用离子交换提取时，会影响树脂对生
8、化物质的交换容量。交换容量。在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。污染，影响过滤效率。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。二、二、发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化1.高价无机离子（高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）2.杂蛋白杂蛋白在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力；量和吸附能力；在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清；使两相分离不清；（一）高价无机离子的去
9、除方法（一）高价无机离子的去除方法2.Mg2+三聚磷酸钠三聚磷酸钠(Na5P3P10)形成形成 三聚磷酸钠镁可溶性络合物三聚磷酸钠镁可溶性络合物 1.Ca2+草酸、草酸、草酸钠草酸钠形成草酸钙形成草酸钙沉淀沉淀（注意回收草酸）（注意回收草酸）3.Fe2+黄血盐黄血盐(K4Fe(CN)6)普鲁士蓝普鲁士蓝 沉淀沉淀（二）杂蛋白的去除方法（二）杂蛋白的去除方法1.沉淀法沉淀法2.变性法变性法 3.吸附法吸附法l在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；酸盐、鞣酸盐、过氯
10、酸盐等形成沉淀；l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和和Pb+等等形成沉淀。形成沉淀。1.沉淀法沉淀法2.变性法变性法 加热，加热，大幅度调节大幅度调节pH值，值，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。性剂等。不足之处不足之处a.加热法只适合于对热较稳定的目的产物；加热法只适合于对热较稳定的目的产物；b.极端极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；消耗大量酸碱；c.有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。
11、较少的场合。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法吸
12、附法n采用凝聚和絮凝技术采用凝聚和絮凝技术能有效改变能有效改变细胞、细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态分散状态，使其使其聚结成较大的颗粒聚结成较大的颗粒，便于提高过滤，便于提高过滤速率。常用于菌体细小而且粘度大的发速率。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。酵液的预处理。第三节第三节 凝聚与絮凝凝聚与絮凝n凝聚凝聚是指在某些电解质作用下，破是指在某些电解质作用下，破坏细胞，菌体和蛋白质等胶体粒子的分坏细胞，菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。散状态，使胶体粒子聚集的过程。一、凝聚一、凝聚概念概念n原理：原理：发酵液发酵液(培养液培养液)中
13、细胞、菌体或蛋白中细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面都带有同种质等胶体粒子的表面都带有同种电荷电荷，使得这，使得这些胶体粒子之间相互排斥，保持一定距离而不些胶体粒子之间相互排斥，保持一定距离而不互相凝聚。另外，这些胶体粒子和水有高度的互相凝聚。另外，这些胶体粒子和水有高度的亲和性，其表面很容易吸住水分，形成一层亲和性，其表面很容易吸住水分，形成一层水水膜膜，从而使胶体粒子呈分散状态。在发酵液，从而使胶体粒子呈分散状态。在发酵液(培养液培养液)中加入电解质，就能中加入电解质，就能中和中和胶体粒子的胶体粒子的电性电性，夺取胶体粒子表面的水分子，夺取胶体粒子表面的水分子，破坏破坏其表其表面的面的水膜
14、水膜，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚集，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚集起来。起来。一、凝聚一、凝聚n阳离子对带负电荷的凝胶凝聚能力的次序为：阳离子对带负电荷的凝胶凝聚能力的次序为：Al3+Fe 3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+无机无机盐类盐类：金属氧金属氧化物类：化物类：Al2(SO4)3.18H2O(明矾明矾)、AlCl3.6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等等Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等或石灰等(2)常用的凝聚剂常用的凝聚剂n絮絮凝凝指指使使用用絮絮凝凝剂剂(通通常常是是天天然然或或合合成成的的大大相相对对分分子子质质量量物物质质)，在在悬悬浮浮离离子
15、子之之间间产产生生架架桥桥作作用用而而使使胶胶粒粒形形成成粗粗大的絮凝团的过程。大的絮凝团的过程。二、絮凝二、絮凝概念概念n絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如）或阳离子（如-NH2）基团以及）基团以及不带电荷的非离子型基团。不带电荷的非离子型基团。n它们通过静电引力、范德华引力或氢键的它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在
16、胶粒的表面。作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生的胶粒表面上，产生桥架连接桥架连接时，就形成时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。了较大的絮团，这就是絮凝作用。二、絮凝二、絮凝絮凝作用示意图絮凝作用示意图必须具有长链的线性结构必须具有长链的线性结构，以便同时与多，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子质量不能超过一定限度，以使其具有良好质量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。的溶解性。分子必须含有相当多的活性官能团分子必须含有相当多的活性官能团，
17、使之能，使之能和胶粒表面相结合；和胶粒表面相结合；2.对絮凝剂化学结构的一般要求对絮凝剂化学结构的一般要求1）有机高分子聚合物有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；衍生物、聚苯乙烯类衍生物；2）无机高分子聚合物无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚，如聚合铝盐、聚合铁盐等；合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。脱乙酰壳多糖等。工业上使用的絮凝剂可分为三类：工业上使用的絮凝剂可分为三类：3.常用的絮凝剂常用的絮凝剂目前最常见的高分子聚合物絮
18、凝剂目前最常见的高分子聚合物絮凝剂:有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物根据活性基团在水中解离情况不同，可分根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：为三类：非离子型、非离子型、阴离子型（含有羧基）阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）阳离子型（含有胺基）3.常用的絮凝剂常用的絮凝剂聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点优点l用量少，一般以用量少，一般以mg/L计量；计量；l絮凝体粗大，分离效果好；絮凝体粗大，分离效果好；l絮凝速度快；絮凝速度快；l种类多，适用范围广。种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点缺点u存
19、在一定的毒性，特别是阳离子型聚存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。谨慎。4.絮凝的影响因素絮凝的影响因素l搅拌速度和时间：搅拌速度和时间：初期高速，接着应延初期高速，接着应延长搅拌时间，降低搅拌速度。长搅拌时间，降低搅拌速度。l絮凝体的浓度：絮凝体的浓度：最佳添加量往往需通最佳添加量往往需通过实验确定过实验确定l溶液的溶液的pH：通过实验确定通过实验确定l絮凝剂的相对分子质量：絮凝剂的相对分子质量：要适当要适当淀粉酶发酵液中淀粉酶发酵液中n对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双
20、重机理才能提高过要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。程，称为混凝。三、混凝三、混凝n对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；第四节第四节 细胞破碎细胞破碎一、细胞壁结构和特点一、细胞壁结构和特点二、细胞破碎率效果的检验二、细胞破碎率效果的检验三、细胞破碎的方法三、细胞破碎的方法四、选择破碎方法的依据四、选择破碎方法的依据五、破碎技术的发展方向
21、五、破碎技术的发展方向细胞破碎就是细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。放到液相中。概念概念微生物微生物革革兰兰氏阳氏阳性性细细菌菌革革兰兰氏阴氏阴性性细细菌菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚/nm/nm20-8020-8010-1310-13100-300100-300100-250100-250层层次次单层单层多多层层多多层层多多层层主要主要组组成成肽肽聚糖聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白蛋白质质脂多糖
22、脂多糖(1-4%)(1-4%)肽肽聚糖聚糖(5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白蛋白质质葡聚糖葡聚糖（30-40%30-40%）甘露聚糖甘露聚糖（30%30%）蛋白蛋白质质(6-8%(6-8%）脂脂类类(8.5-13.5%)(8.5-13.5%)多聚糖多聚糖（80-90%80-90%）脂脂类类蛋白蛋白质质一、一、细胞壁的结构和特点细胞壁的结构和特点u由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。细胞壁有所提高。1.微生物细胞壁的
23、化学组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构u细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大；度越大；u酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；壁结构交联的紧密程度和它的厚度；2.植物细胞壁的化学组成和结构植物细胞壁的化学组成和结构u成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时，生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时，细胞不再增大。细胞不再增大。u初生壁与次生壁的主要化学成分均
24、为纤维素。初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。u在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞壁的组成最重要，其次是细胞壁的结构。壁的组成最重要，其次是细胞壁的结构。3.细胞壁的结构与细胞的破碎细胞壁的结构与细胞的破碎u在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。细胞个体小、呈球形、难易程度的
25、重要因素。细胞个体小、呈球形、壁厚、聚合交联程度高则难破碎。壁厚、聚合交联程度高则难破碎。二、细胞破碎效果的检查二、细胞破碎效果的检查 破碎率定义破碎率定义:被破碎的细胞的数量占原被破碎的细胞的数量占原始细胞数量的百分数，即始细胞数量的百分数，即其中其中N0：原细胞数，：原细胞数，N：破碎后残存：破碎后残存的正常细胞。的正常细胞。N0和和N的可通过的可通过直接测直接测定法、目的产物测定法和测定导电率定法、目的产物测定法和测定导电率得到。得到。1.直接测定法直接测定法显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。破碎的细胞与未破
26、碎的细胞区别开来。方法：样本适当稀释后，通过方法：样本适当稀释后，通过平板计数技术平板计数技术或或在血球计数板上用在血球计数板上用显微镜观察显微镜观察来实现染色细胞来实现染色细胞的技术。的技术。平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，误差大；细胞聚集时，不利计数。误差大；细胞聚集时，不利计数。2.目标产物测定法目标产物测定法Rm：理论最大值，：理论最大值，R：实验测得值。：实验测得值。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，
27、并与或活性，并与100%100%破碎率所获得的标准数值比破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。较，计算其破碎率。3.测定导电率测定导电率细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。破碎率的增加而呈线性增加。导电率的大小取决于微生物的种类、处导电率的大小取决于微生物的种类、处理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液中原电介质的含量等，因此，正式测定中原电介质的含量等，因此，正式测定前，应预先用其它方法测定标准曲线。前，应预先用其它方法测定标准曲线。
28、分分 类类作用机理作用机理适适应应性性物物理理破破碎碎高高压压匀匀浆浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达可达较较高破碎率，可大高破碎率，可大规规模操作，不适模操作，不适合合丝丝状菌和革状菌和革兰兰氏阳性菌氏阳性菌珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达可达较较高破碎率，可高破碎率，可较较大大规规模操作，大模操作，大分子目的分子目的产产物易失活，物易失活，浆浆液分离困液分离困难难超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对对酵母菌效果酵母菌效果较较差，破碎差，破碎过过程升温程升温剧剧烈，烈，不适合大不适合大规规模操作模操作渗透渗透压压法法渗透渗透压剧压剧烈改烈改变变破碎率破碎率较较低，常与其他方
29、法低，常与其他方法结结合使用合使用反复反复冻冻融法融法反复反复冻结冻结-融化融化破碎率破碎率较较低，不适合低，不适合对对冷冷冻冻敏感目的敏感目的产产物物干燥法干燥法改改变细变细胞膜的渗透性胞膜的渗透性条件条件变变化化剧剧烈，易引起大分子物烈，易引起大分子物质质失活失活X-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，破碎率高，活性保留率高，对对冷冷冻冻敏感敏感目的目的产产物不适合物不适合化化学学破破碎碎酶酶溶法溶法酶酶分解作用分解作用具有高度具有高度专专一性，条件温和，一性，条件温和，浆浆液易分液易分离，溶离，溶酶酶价格高，通用性差价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改改变细变
30、细胞膜渗透性胞膜渗透性具一定具一定选择选择性，性，浆浆液易分离，但液易分离，但释释放率放率较较低，通用性差低，通用性差三、三、细胞破碎的方法细胞破碎的方法（按细胞所受作用）（按细胞所受作用）高压匀浆法高压匀浆法珠磨法珠磨法超声破碎法超声破碎法渗透压法渗透压法反复冻融法反复冻融法干燥法干燥法X-press法法1.1.物理破碎物理破碎(1)高压匀浆法（高压匀浆法（High-pressure homogenization）大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高的环隙高速喷出，每
31、秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到剪切、碰撞及由高压到常压的变化常压的变化，从而造成细胞破碎。，从而造成细胞破碎。原理：原理：进进口口出出口口高压均浆法中影响细胞破碎的因素主要有高压均浆法中影响细胞破碎的因素主要有压压力、循环操作次数和温度力、循环操作次数和温度。一般来说，增大一般来说，增大压力和增加破碎次数可提高破碎率，但当压压力和增加破碎次数可提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对均浆器的磨损较大，
32、力增大到一定程度后对均浆器的磨损较大，工业生产中常用工业生产中常用5570MPa的压力。对于的压力。对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多多次循环次循环的操作方法。的操作方法。破碎率随温度的增加而破碎率随温度的增加而增加增加，但高温破碎只适用于非热变性产物。，但高温破碎只适用于非热变性产物。高压匀浆法中影响细胞破碎的因素高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:不宜采用高压匀浆法的微生物：不宜采用高压匀浆法的微生物：n易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，n较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，n含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，含有包含体
33、的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）易损伤匀浆阀）适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热
34、量出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。一般采用夹套冷却的方式带走。(2)珠磨法（珠磨法（Bead mill）工作原理：工作原理：卧卧式式n实验室规模的细胞破碎设备有实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速高速组织捣碎机、组织捣碎机、Braun匀浆器；匀浆器；n中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；n在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。公司和德国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、以下：降低能耗、减少大分
35、子目的产物的失活、减少由于高破碎率减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。困难。影响细胞破碎的因素影响细胞破碎的因素nb.珠体的装量珠体的装量na.珠体的大小珠体的大小nc.搅拌速度搅拌速度nd.操作温度操作温度ne.被处理细胞的特性被处理细胞的特性 实验室规模，珠径实验室规模，珠径0.2mm，工业规模珠径大于工业规模珠径大于0.4mm8090适当适当540珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80以下以下n其原理其原理可能与可能与空空穴穴现象现象引起的冲击波和剪引起的冲击波和剪切作用有关。切
36、作用有关。3.超声破碎法超声破碎法（Ultrasonication）n超生波破碎细胞时的频率一般为超生波破碎细胞时的频率一般为1520 kHz，功率为，功率为100250W，可分为，可分为槽槽式和式和探头直接插入介质式探头直接插入介质式两种型式。两种型式。（3）超声波破碎法）超声波破碎法n影响超生波破碎的因素主要有超声波影响超生波破碎的因素主要有超声波的声强、频率、破碎时间、介质的离子的声强、频率、破碎时间、介质的离子强度、强度、pH、菌体的浓度和种类。、菌体的浓度和种类。n一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。细菌易破碎，对酵母菌的效
37、果较差。超声破碎时细胞浓度一般在超声破碎时细胞浓度一般在20左右。左右。（3）超声波破碎法）超声波破碎法n超声波破碎法在超声波破碎法在实验室和小规模生产实验室和小规模生产中中应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷却到却到05，并且还应在夹套中连续通，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行入冷却剂进行冷却冷却。n另外，超声波产生的另外，超声波产生的化学自由基团化学自由基团能使能使某些敏感性活性物质某些敏感性活性物质失活失活。可以通过添。可以通过添加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和
38、。将细胞放在高渗透压的介质中（如一定将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。内，引起细胞溶胀，甚至破裂。（4 4）渗透压冲击法）渗透压冲击法（Osmotic pressureOsmotic pressure）仅适用于仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），抑制剂（
39、如抗生素等），使细胞壁有缺使细胞壁有缺陷，强度减弱。陷，强度减弱。将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。度变化，引起细胞膨胀而破裂。（5 5）反复冻融法）反复冻融法适用于适用于细胞壁较脆弱的菌体细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变
40、性。可能引起某些蛋白质变性。使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。易被抽提出来。（6 6）干燥法）干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥气流干燥气流干燥主要适用于酵母菌主要适用于酵母菌，一般在一般在2530的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥真空干燥多用于细菌多用于细菌；冷冻干燥冷冻干燥适用于较不稳定的物质适用于较不稳定的物质。此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却
41、至-25形成冰晶体，利用形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而破碎。形而破碎。（7 7）X-pressX-press法法该法该法主要用于实验室主要用于实验室，具有具有使用范围广、使用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高留率高等优点等优点。不适用于对冷冻敏感的物不适用于对冷冻敏感的物质。质。酶溶法酶溶法化学试剂化学试剂破碎法破碎法外加酶法外加酶法自溶法自溶法表面活性物质表面活性物质EDT
42、A螯合剂螯合剂有机溶剂有机溶剂变性剂变性剂2.化学破碎化学破碎（Chemical permeation）（1）酶溶法）酶溶法（Enzymatic Lysis）外加酶法外加酶法常常用用的的溶溶酶酶G+溶菌酶、适量抑制剂溶菌酶、适量抑制剂G-溶菌酶、溶菌酶、EDTA放线菌放线菌 溶菌酶溶菌酶酵母菌酵母菌 -葡聚糖酶葡聚糖酶霉菌霉菌 几丁质酶、几丁质酶、植物植物 纤维素酶、半纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶细胞壁溶解酶是几种酶的复合物细胞壁溶解酶是几种酶的复合物选择性释放产物，条件温和，核酸泄出选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。量少，细胞外形完整。溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种
43、溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。需选择不同的酶），产物抑制的存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。酶溶法的优点：酶溶法的优点：酶溶法的缺点：酶溶法的缺点：u缺点是：对不稳定的微生物，易引起所缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。增大，过滤速度下降。（2）自溶法（）自溶法（Autolysis）u诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细
44、胞自溶的目的。身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。u影响自溶过程的主要因素有温度、时间、影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。有选择地渗透出来。（2）化学试剂破碎法）化学试剂破碎法（Chemical
45、 permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。构与组成。用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。成游离的氨基酸。如如Triton X-100是一种非离子型清洁剂是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如其他的表面活性剂，
46、如牛黄胆酸钠、十二牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。等也可使细胞破碎。表面活性剂表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。助于细胞的破碎。处理处理G-细菌细菌，对细胞外层膜有破坏作用。，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦一旦EDTA将将Ca2+或或Mg2+螯合，大量的螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷
47、脂来填补，洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。从而导致内层膜通透性的增强。EDTA螯合剂螯合剂能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。有机溶剂有机溶剂变性剂变性剂盐酸胍盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和和脲脲（Urea）是常用的变性剂。）是常用的变性剂。常用的有机溶剂常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。二甲苯、氯仿及高级醇等。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。疏水作用，从而使疏水性化合物溶
48、于水溶液。l通用性差；通用性差；l时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过过50%l有些化学试剂有毒有些化学试剂有毒。化学法的优点：化学法的优点：缺点：缺点：l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。固液分离和进一步提取。细胞破碎方法细胞破碎方法（按是否使用外加作用力）（按
49、是否使用外加作用力）分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达可达较较高破碎率，高破碎率，可可较较大大规规模操作模操作，大，大分子目的分子目的产产物易失活，物易失活，浆浆液分离困液分离困难难高高压压匀匀浆浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达可达较较高破碎率，高破碎率，可大可大规规模操作模操作，不适，不适合合丝丝状菌和革状菌和革兰兰氏阳性菌氏阳性菌超声破碎超声破碎法法液体剪切作用液体剪切作用对对酵母菌效果酵母菌效果较较差，破碎差，破碎过过程升温程升温剧剧烈，烈，不适合大不适合大规规模操作模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体
50、剪切作用破碎率高，活性保留率高，破碎率高，活性保留率高，对对冷冷冻冻敏感敏感目的目的产产物不适合物不适合非非机机械械法法酶酶溶法溶法酶酶分解作用分解作用具有高度具有高度专专一性，条件温和，一性，条件温和，浆浆液易分液易分离，溶离，溶酶酶价格高，通用性差价格高，通用性差化学渗透化学渗透法法改改变细变细胞膜的渗透胞膜的渗透性性具一定具一定选择选择性，性，浆浆液易分离，但液易分离，但释释放率放率较较低，通用性差低，通用性差渗透渗透压压法法渗透渗透压剧压剧烈改烈改变变破碎率破碎率较较低，常与其他方法低，常与其他方法结结合使用合使用冻结冻结融化融化法法反复反复冻结冻结-融化融化破碎率破碎率较较低，不适合