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1、第二章预处理及固液分离技术第1页，共67页，编辑于2022年，星期二主要内容预处理的本质（固预处理的本质（固-液分离）液分离）发酵液的相对纯化方法发酵液的相对纯化方法絮凝的基本原理和影响因素絮凝的基本原理和影响因素细胞破碎的方法细胞破碎的方法影响离心分离的因素、方法及设备影响离心分离的因素、方法及设备第2页，共67页，编辑于2022年，星期二预处理的目的预处理的目的改变发酵液的物理性质，改善流体性能，提高过滤速改变发酵液的物理性质，改善流体性能，提高过滤速率。率。使目的产物转相便于后处理（多数是液相）。使目的产物转相便于后处理（多数是液相）。去除发酵液中的部分杂质，便于后续操作。去除发酵液中的
2、部分杂质，便于后续操作。发酵液的预处理发酵液的预处理目的产品在发酵液中浓度很低目的产品在发酵液中浓度很低与许多杂质（溶解的和悬浮的）夹在一起，与许多杂质（溶解的和悬浮的）夹在一起，发酵液属于非牛顿型流体发酵液属于非牛顿型流体需进行预处理需进行预处理由于由于第3页，共67页，编辑于2022年，星期二通过微生物发酵或动植物培养得到的原料液应首先将其通过微生物发酵或动植物培养得到的原料液应首先将其中的菌体或细胞与培养液分离。中的菌体或细胞与培养液分离。如果目标产物为胞外代谢物则直接对培养液如果目标产物为胞外代谢物则直接对培养液进行分离纯化；进行分离纯化；如果目标产物为胞内代谢产物，要对细胞进行处如果
3、目标产物为胞内代谢产物，要对细胞进行处理，释放目标产物，然后除去细胞碎片，再进行理，释放目标产物，然后除去细胞碎片，再进行目标物质的纯化。目标物质的纯化。（在合适的培养基（在合适的培养基pH、温度和通气搅拌或经厌、温度和通气搅拌或经厌氧条件下进行生长并合成生物活性物质）氧条件下进行生长并合成生物活性物质）（包括菌体、胞外（包括菌体、胞外代谢产物或胞内酶代谢产物或胞内酶或核酸等）或核酸等）第4页，共67页，编辑于2022年，星期二一、预处理特性的改变方法一、预处理特性的改变方法取决于可分离物质的性质，主要考虑目的物质的分子大小、取决于可分离物质的性质，主要考虑目的物质的分子大小、热稳定性、热稳定
4、性、pH的适应性。的适应性。加热：加热：最简单最经济的预处理方法（常用）最简单最经济的预处理方法（常用）加热能使液体粘度降低，过滤速度加快。加热能使液体粘度降低，过滤速度加快。该方法只适合于对热较稳定的生化物质，加热的该方法只适合于对热较稳定的生化物质，加热的温度和时间须严加选择。温度和时间须严加选择。第5页，共67页，编辑于2022年，星期二调调pHl改变发酵液的胶体状态改变发酵液的胶体状态l使产物转入液相使产物转入液相l使杂质（蛋白、多糖、使杂质（蛋白、多糖、Ca2+等）发生沉淀。等）发生沉淀。一般用草酸或无机酸、碱来调节。一般用草酸或无机酸、碱来调节。通常加热和调通常加热和调pH协同作用
5、。协同作用。链霉素生产发酵液预处理时，采用调链霉素生产发酵液预处理时，采用调pH3.0左左右，加热至右，加热至70，维持半小时以凝固蛋白质，这，维持半小时以凝固蛋白质，这样可使过滤速度增大样可使过滤速度增大10100倍，滤液粘度降低倍，滤液粘度降低为原先的为原先的1/6。例例第6页，共67页，编辑于2022年，星期二加入某些反应剂，某些物质或杂加入某些反应剂，某些物质或杂质能转为助滤剂，可消除这些物质质能转为助滤剂，可消除这些物质对过滤的影响，从而提高速率。对过滤的影响，从而提高速率。正确选择能提高正确选择能提高3-10倍速率倍速率 反应剂反应剂第7页，共67页，编辑于2022年，星期二助助滤
6、滤剂剂是是一一种种具具有有特特殊殊性性能能的的细细粉粉或或纤纤维维，它它能能使使某某些些难难于于过过滤滤的的物物料料变变得得容容易易过过滤。滤。硅硅藻藻土土和和珍珍珠珠岩岩是是两两种种最最常常用用的的助助滤滤剂剂。硅硅藻藻土土是是几几百百年年前前的的水水生生植植物物沉沉淀淀下下来的遗骸，珍珠岩是处理过的膨胀火山岩来的遗骸，珍珠岩是处理过的膨胀火山岩。助滤剂助滤剂第8页，共67页，编辑于2022年，星期二二、去除杂质的具体方法二、去除杂质的具体方法1、无机离子利用沉淀作用无机离子利用沉淀作用钙离子：加草酸或磷酸盐钙离子：加草酸或磷酸盐镁离子：磷酸盐镁离子：磷酸盐铁离子：加黄血盐，生成普鲁士蓝沉淀
7、铁离子：加黄血盐，生成普鲁士蓝沉淀2、可溶性蛋白质可溶性蛋白质发酵液的预处理主要是如何使可溶性蛋白质发酵液的预处理主要是如何使可溶性蛋白质变性沉淀除去。变性沉淀除去。第9页，共67页，编辑于2022年，星期二蛋白质的性质和变性机理蛋白质的性质和变性机理1）沉淀法：酸性溶液与碱性溶液）沉淀法：酸性溶液与碱性溶液2）变性法：加热、调）变性法：加热、调pH、酒精、丙酮、表面活性剂、酒精、丙酮、表面活性剂3）吸附法：有色物质）吸附法：有色物质常用的是离子交换剂、离子交换纤维、活性碳等材料的常用的是离子交换剂、离子交换纤维、活性碳等材料的吸附法。吸附法。如：强碱性阴离子交换剂用于酪蛋白酶或果胶酶的脱色。
8、如：强碱性阴离子交换剂用于酪蛋白酶或果胶酶的脱色。阴离子交换树脂用于谷氨酸发酵液脱色。阴离子交换树脂用于谷氨酸发酵液脱色。第10页，共67页，编辑于2022年，星期二三、凝聚和絮凝三、凝聚和絮凝凝聚与絮凝在预处理中常用于细胞、菌体（胞外产凝聚与絮凝在预处理中常用于细胞、菌体（胞外产物）、细胞碎片（胞内产物）以及蛋白质等胶体粒物）、细胞碎片（胞内产物）以及蛋白质等胶体粒子的去除。子的去除。与热处理和加无机电解质相比，作用条件温和，实验剂与热处理和加无机电解质相比，作用条件温和，实验剂量小。量小。1）凝聚作用是指在某些电解质作用下，由于胶粒之间双电）凝聚作用是指在某些电解质作用下，由于胶粒之间双电
9、层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。现象。第11页，共67页，编辑于2022年，星期二通常发酵液中细胞或菌体带负电荷，由于静电引通常发酵液中细胞或菌体带负电荷，由于静电引力的作用将溶液中带相反电性的粒子（即正离子）力的作用将溶液中带相反电性的粒子（即正离子）吸附在周围，在界面上形成了双电层。吸附在周围，在界面上形成了双电层。反离子化合价越高，即凝聚能力越强。反离子化合价越高，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+Ca2+Mg2+K+Na+Li+。常用的凝聚
10、剂有：常用的凝聚剂有：Al2(S04)318H20(明矾明矾)；AlCl36H20；FeCl3；ZnS04；MgC03等等第12页，共67页，编辑于2022年，星期二2）絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于）絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。絮凝剂必须具有长链线状的结构，易溶于水，在絮凝剂必须具有长链线状的结构，易溶于水，在长的链节上含有相当多的活性功能团。长的链节上含有相当多的活性功能团。絮凝剂的功能团强烈地吸附在胶粒的表面上。絮凝剂的功能团强烈地吸附在胶粒的表面上。一个高分子聚合物的许多功能基团分别吸
11、附在不一个高分子聚合物的许多功能基团分别吸附在不同颗粒的表面上，因而产生架桥联接。同颗粒的表面上，因而产生架桥联接。第13页，共67页，编辑于2022年，星期二絮凝剂包括各种天然聚合物和人工合成聚合物。絮凝剂包括各种天然聚合物和人工合成聚合物。天然絮凝剂：多糖、海藻酸钠、明胶和骨胶等。天然絮凝剂：多糖、海藻酸钠、明胶和骨胶等。无毒、无毒、使用安全、适于食品或医药。使用安全、适于食品或医药。人工合成的絮凝剂：聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类物和聚人工合成的絮凝剂：聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类物和聚丙烯酸类聚合物等。丙烯酸类聚合物等。某些絮凝剂可能具有一定的毒性，在食品和医药工某些絮凝剂可能具有一定的毒性，在
12、食品和医药工业的使用中应考虑最终能否从产品中除去。业的使用中应考虑最终能否从产品中除去。第14页，共67页，编辑于2022年，星期二第四节第四节 细胞破碎细胞破碎第15页，共67页，编辑于2022年，星期二定义定义:细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化用不同的分离手段进一步纯化.第16页，共67页，编辑于2022年，星期
13、二一、细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构细菌：肽聚糖的网状结构细菌：肽聚糖的网状结构酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌：聚合物的网状结构、几丁质、纤真菌：聚合物的网状结构、几丁质、纤维素的纤维状结构维素的纤维状结构植物细胞壁的化学组成和结构植物细胞壁的化学组成和结构初生壁，次生壁初生壁，次生壁具有很高的机械强度具有很高的机械强度第17页，共67页，编辑于2022年，星期二二、细胞破碎效果的检查二、细胞破碎效果的检查直接测定法直接测定法 测定破碎前后的细胞数量测定破碎前后的细胞数量目的产物测定法目的产物测
14、定法 测定破碎液中目的产物的释放量（含量、活测定破碎液中目的产物的释放量（含量、活性）性）测定导电率测定导电率 导电率随着破碎率的增加而呈线性增加导电率随着破碎率的增加而呈线性增加第18页，共67页，编辑于2022年，星期二三、细胞破碎技术三、细胞破碎技术机械法和非机械法机械法和非机械法机械法机械法 机械法主要是利用高压、研磨或超声波机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的。目的。包括高压匀浆法、珠磨法和超声破碎法。包括高压匀浆法、珠磨法和超声破碎法。第19页，共67页，编辑于2022年，星期二高压匀浆器高压匀浆器影响匀浆破
15、碎的主要影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。通过匀浆器阀的次数。高压匀浆法的适用范高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规胞和植物细胞的大规模处理中常采用模处理中常采用。第20页，共67页，编辑于2022年，星期二高速珠磨机（高速珠磨机（high high spced bead millspced bead mill）研磨是常用的一种方研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞起快速搅拌，使细胞获得破碎。获得破碎。在工业规模
16、的破碎中在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机。常采用高速珠磨机。第21页，共67页，编辑于2022年，星期二超声波破碎器超声波破碎器超声波处理细胞悬浮液时，超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响响，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋很大，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影白质变性，频率的变化影响不明显：此外介质的离响不明显：此外介质的离子强度、子强度、pHpH值、菌体的种值、菌体的种类和浓度也有很大的影响。类和浓度也有很大的影响。第22页，共67页，编辑于2022年，星期二超声波振荡过程中超声波振荡过程中遇到的最大问题就遇到的最大问题
17、就是产生的热量不容是产生的热量不容易驱散，所以影响易驱散，所以影响了它在大规模工业了它在大规模工业上的应用，但在实上的应用，但在实验室和小规模生产验室和小规模生产中是一种很好的方中是一种很好的方法。法。第23页，共67页，编辑于2022年，星期二非机械法非机械法 非机械方法很多，包括酶解、渗透压非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等。冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等。酶解法酶解法 是利用酶反应，分解破坏细胞壁上是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用在细
18、胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。自溶作用。酶解法的优点是发生酶解的条件温和、酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广。解价格高，故小规模应用较广。第24页，共67页，编辑于2022年，星期二渗透压冲击法渗透压冲击法冻融法冻融法干燥法干燥法化学法化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。剂和有机溶剂
19、等化学试剂。第25页，共67页，编辑于2022年，星期二选择破碎方法的依据选择破碎方法的依据(1)(1)细胞的处理量细胞的处理量(2)(2)细胞壁的强度和结构细胞壁的强度和结构(3)(3)目标产物对破碎条件的敏感性目标产物对破碎条件的敏感性(4)(4)破碎程度破碎程度 适宜的操作条件应从高的产物释放率、适宜的操作条件应从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面进行权低的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡衡第26页，共67页，编辑于2022年，星期二破碎技术研究的方向破碎技术研究的方向(1)(1)多种破碎法的结合多种破碎法的结合(2)(2)与上游技术结合与上游技术结合(3)(3)与下游操作
20、技术结合与下游操作技术结合第27页，共67页，编辑于2022年，星期二第五节第五节 离心技术离心技术第28页，共67页，编辑于2022年，星期二离心分离方法离心分离方法（1 1）差速离心分离生化工业中最常用分离方法）差速离心分离生化工业中最常用分离方法实际物系的特点、分离目的、分离程度实际物系的特点、分离目的、分离程度（目标产物和其它组分的性（目标产物和其它组分的性质及相互作用等）质及相互作用等）选择适当的操作条件（离心转数和时间）选择适当的操作条件（离心转数和时间）使料液的不同组分得到分级分离使料液的不同组分得到分级分离第29页，共67页，编辑于2022年，星期二细胞破细胞破碎液碎液离心离心
21、600g,10min沉降层沉降层/细胞核（细胞核（46m)上清液上清液(细胞膜碎片、线粒体、溶菌细胞膜碎片、线粒体、溶菌体、核糖体、水溶性物质体、核糖体、水溶性物质离心离心(10000g,10min)沉降层沉降层（细胞膜碎片、线（细胞膜碎片、线粒体、溶菌酶）粒体、溶菌酶）上清液上清液（核糖体、水溶性物质（核糖体、水溶性物质）离心（离心（100000g，3h)上清液上清液(水溶性物质）水溶性物质）沉降层（核糖体）沉降层（核糖体）细胞破碎液的差速离心分离细胞破碎液的差速离心分离第30页，共67页，编辑于2022年，星期二（2 2）区带离心生化研究的重要分离手段）区带离心生化研究的重要分离手段（差速
22、区带离心和平衡区带离心）（差速区带离心和平衡区带离心）l在离心管中用某种低分子溶质（如蔗糖）调配好密在离心管中用某种低分子溶质（如蔗糖）调配好密度梯度（从大到小加入）度梯度（从大到小加入）l在密度梯度之上加待处理的料液在密度梯度之上加待处理的料液l然后进行离心操作然后进行离心操作区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。第31页，共67页，编辑于2022年，星期二差速区带离心差速区带离心:密度梯度最大的密度密度梯度最大的密度待分离的目标产物密度待分离的目标产物密度得
23、到纯化的各组分得到纯化的各组分在离心操作中在离心操作中料液中各个组分在密度梯度中以不同的速度沉降料液中各个组分在密度梯度中以不同的速度沉降据沉降系数差别形成各自的区带据沉降系数差别形成各自的区带经过一定时间经过一定时间分别汲取不同的区带分别汲取不同的区带第32页，共67页，编辑于2022年，星期二平衡区带离心平衡区带离心平衡区带离心的密度梯度比差速离心的密度梯度大。平衡区带离心的密度梯度比差速离心的密度梯度大。l料液中高分子物质在与自身密度相等的溶剂密度处形成稳料液中高分子物质在与自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带。定的区带。l区带中的高分子物质浓度以该密度处浓度为中心，呈高斯分布。区带中
24、的高分子物质浓度以该密度处浓度为中心，呈高斯分布。离心的结果离心的结果第33页，共67页，编辑于2022年，星期二（3 3）等密度离心法）等密度离心法 等密度离心的有效等密度离心的有效分离仅取决于粒子分离仅取决于粒子的密度差，与粒子的密度差，与粒子的大小和形状无关，的大小和形状无关，但是此二者决定着但是此二者决定着达到平衡的速度、达到平衡的速度、时间和区带宽度。时间和区带宽度。第34页，共67页，编辑于2022年，星期二离心分离设备及处理能力离心分离设备及处理能力离心机是生物相关实验室及生物制品生产企离心机是生物相关实验室及生物制品生产企业广泛使用的分离设备。业广泛使用的分离设备。实验室用离心
25、机以离心管式转子离心机为实验室用离心机以离心管式转子离心机为主，为间歇式。（一般为冷冻离心机）主，为间歇式。（一般为冷冻离心机）工业用离心设备一般要求有较大的处理能工业用离心设备一般要求有较大的处理能力并连续操作。力并连续操作。常用的有管式和蝶式两大类。常用的有管式和蝶式两大类。第35页，共67页，编辑于2022年，星期二离心机处理能力（一定时间内处理多少料液量）离心机处理能力（一定时间内处理多少料液量）Q=Vg：具具有有面面积积的的单单位位，称称为为离离心心沉沉降降面面积积，是是离离心心机机结结构构和和操操作作条条件件的函数。的函数。L:离心管长离心管长r2:离心机转筒内径离心机转筒内径：旋
26、转角速度：旋转角速度2NN：离心机转数（：离心机转数（s-1)gL r2222=1 1）管式离心机管式离心机第36页，共67页，编辑于2022年，星期二第37页，共67页，编辑于2022年，星期二2 2）碟片式离心机）碟片式离心机处理能力处理能力Q=Vg2n(r13-r23)23gtanr1、r2分别为分离板的外径分别为分离板的外径和内径，和内径，n为分离板数，为分离板数，为分离板与旋转轴的夹为分离板与旋转轴的夹角角.第38页，共67页，编辑于2022年，星期二第39页，共67页，编辑于2022年，星期二大容量冷冻离心机大容量冷冻离心机离心分离设备离心分离设备第40页，共67页，编辑于2022
27、年，星期二细胞与发酵液分离的方法（细胞与发酵液分离的方法（5种）种）重力沉降、重力沉降、离心分离、离心分离、过滤过滤双水相萃取双水相萃取泡沫分离法泡沫分离法第41页，共67页，编辑于2022年，星期二2.2重力沉降重力沉降【自学】【自学】重力沉降设备体积庞大，分离效率低。重力沉降设备体积庞大，分离效率低。具有设备简单，制造容易，能耗低等优点，在食具有设备简单，制造容易，能耗低等优点，在食品、发酵，特别是环境工程中得到应用。品、发酵，特别是环境工程中得到应用。菌体或动植物细胞的重力沉降虽然简单易行，菌体或动植物细胞的重力沉降虽然简单易行，因菌体细胞体积小，沉降速度很慢，不适于应用。因菌体细胞体积
28、小，沉降速度很慢，不适于应用。第42页，共67页，编辑于2022年，星期二2.3离心沉降离心沉降离心沉降是科研与生产实践最广泛使用的非均相分离手段。离心沉降是科研与生产实践最广泛使用的非均相分离手段。适用于菌体或细胞的回收或除去，适用于菌体或细胞的回收或除去，用于血球、细胞器、病毒及蛋白质分离，用于血球、细胞器、病毒及蛋白质分离，应用于液液相分离。应用于液液相分离。2.3.1离心沉降速度离心沉降速度重力重力g作用下的沉降作用下的沉降速度速度dP:粒径，粒径，S:颗粒密度，颗粒密度，L：液体密度，：液体密度，L：液：液体粘度体粘度第43页，共67页，编辑于2022年，星期二离心力离心力Fc=r2
29、r:粒子的离心半径粒子的离心半径，：旋转角速度，：旋转角速度，N：离心机转速（：离心机转速（s-1)离心沉降速度离心沉降速度旋转角速度旋转角速度=2N第44页，共67页，编辑于2022年，星期二2.3.2 沉降系数沉降系数（S)沉降系数沉降系数 S S：是溶剂物性的函数，是溶剂物性的函数，是溶质颗粒浓度的函数（成反比），是溶质颗粒浓度的函数（成反比），是溶质相对分子量的函数（成正比）是溶质相对分子量的函数（成正比）=S第45页，共67页，编辑于2022年，星期二2.3.3离心沉降溶质完全沉淀所需的时间离心沉降溶质完全沉淀所需的时间t=ln(R2/R1)S2R1、R2：旋转轴中心到样品液表面和：
30、旋转轴中心到样品液表面和离心管底部的垂直距离离心管底部的垂直距离旋转角速度旋转角速度2NN：离心机：离心机转转数（数（s-1)2.3.4分离因数分离因数Z=42N2r/g是离心力与重力的比值，是离心力与重力的比值，是衡量离心程度的参数是衡量离心程度的参数（r:粒子的离心半径）粒子的离心半径）第46页，共67页，编辑于2022年，星期二（差速区带离心和平衡区带离心）（差速区带离心和平衡区带离心）2.3.5离心分离方法（差速离心及区带离心）离心分离方法（差速离心及区带离心）（1）差速离心分离生化工业中最常用分离方法）差速离心分离生化工业中最常用分离方法实际物系的特点、分离目的、分离程度实际物系的特
31、点、分离目的、分离程度（目标产物和其它组分的性（目标产物和其它组分的性质及相互作用等）质及相互作用等）选择适当的操作条件（离心转数和时间）选择适当的操作条件（离心转数和时间）使料液的不同组分得到分级分离使料液的不同组分得到分级分离第47页，共67页，编辑于2022年，星期二细胞破细胞破碎液碎液离心离心600g,10min沉降层沉降层/细胞核（细胞核（46m)上清液上清液(细胞膜碎片、线粒体、溶菌细胞膜碎片、线粒体、溶菌体、核糖体、水溶性物质体、核糖体、水溶性物质离心离心(10000g,10min)沉降层沉降层（细胞膜碎片、线（细胞膜碎片、线粒体、溶菌酶）粒体、溶菌酶）上清液上清液（核糖体、水溶
32、性物质（核糖体、水溶性物质）离心（离心（100000g，3h)上清液上清液(水溶性物质）水溶性物质）沉降层（核糖体）沉降层（核糖体）细胞破碎液的差速离心分离细胞破碎液的差速离心分离第48页，共67页，编辑于2022年，星期二（2）区带离心生化研究的重要分离手段）区带离心生化研究的重要分离手段（差速区带离心和平衡区带离心）（差速区带离心和平衡区带离心）l在离心管中用某种低分子溶质（如蔗糖）调在离心管中用某种低分子溶质（如蔗糖）调配好密度梯度（从大到小加入），配好密度梯度（从大到小加入），l在密度梯度之上加待处理的料液在密度梯度之上加待处理的料液l然后进行离心操作。然后进行离心操作。区带离心法可用
33、于蛋白质、核酸等生物大分子的分区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。第49页，共67页，编辑于2022年，星期二差速区带离心差速区带离心:密度梯度最大的密度密度梯度最大的密度待分离的目标产物密度待分离的目标产物密度.得到纯化的各组分得到纯化的各组分在离心操作中在离心操作中料液中各个组分在密度梯度中以不同的速度沉降料液中各个组分在密度梯度中以不同的速度沉降据沉降系数差别形成各自的区带据沉降系数差别形成各自的区带经过一定时间经过一定时间分别汲取不同的区带分别汲取不同的区带第50页，共67页，编辑于2022年，
34、星期二平衡区带离心平衡区带离心平衡区带离心的密度梯度比差速离心的密度梯度大。平衡区带离心的密度梯度比差速离心的密度梯度大。l料液中高分子物质在与自身密度相等的溶剂密度处形料液中高分子物质在与自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带。成稳定的区带。l区带中的高分子物质浓度以该密度处浓度为中心，呈区带中的高分子物质浓度以该密度处浓度为中心，呈高斯分布。高斯分布。离心的结果离心的结果第51页，共67页，编辑于2022年，星期二2.3.6离心分离设备及处理能力离心分离设备及处理能力离心机是生物相关实验室及生物制品生产企业广泛使用的离心机是生物相关实验室及生物制品生产企业广泛使用的分离设备。分离设备。实验
35、室用离心机以离心管式转子离心机为主，为间实验室用离心机以离心管式转子离心机为主，为间歇式。歇式。一般为冷冻离心机。一般为冷冻离心机。工业用离心设备一般要求有较大的处理能力并连续工业用离心设备一般要求有较大的处理能力并连续操作。操作。常用的有管式和蝶式两大类。常用的有管式和蝶式两大类。第52页，共67页，编辑于2022年，星期二离心机处理能力（一定时间内处理多少料液量）离心机处理能力（一定时间内处理多少料液量）Q=Vg：具具有有面面积积的的单单位位，称称为为离离心心沉沉降降面面积积，是是离离心心机机结结构构和和操操作作条条件件的函数。的函数。L:离心管长离心管长r2:离心机转筒内径离心机转筒内径
36、：旋转角速度：旋转角速度2NN：离心机转数（：离心机转数（s-1)gL r2222=1）管式离心机管式离心机第53页，共67页，编辑于2022年，星期二2 2）碟片式离心机）碟片式离心机处理能力处理能力Q=Vg2n(r13-r23)23gtanr1、r2分别为分离板的外分别为分离板的外径和内径，径和内径，n为分离板数，为分离板数，为分离板与旋转轴的夹为分离板与旋转轴的夹角角.第54页，共67页，编辑于2022年，星期二2.4 过滤过滤-以压力差为透过推动力以压力差为透过推动力2.4.1过滤速度及过滤基本方程（自学）过滤速度及过滤基本方程（自学）V=P(RC+Rm)P:压力差：滤液粘度RC：滤饼
37、阻力Rm：过滤介质阻力第55页，共67页，编辑于2022年，星期二2.4.2传统过滤设备（封头过滤）传统过滤设备（封头过滤）1）板框压滤机）板框压滤机传传统统的的过过滤滤设设备备，至至今今仍仍在在各各个个领领域域广广泛泛应应用用，发发酵酵工业中以抗菌素生产厂用得最多。工业中以抗菌素生产厂用得最多。结构简单，装配紧凑，过滤面积大；结构简单，装配紧凑，过滤面积大；允允许许采采用用较较大大的的操操作作压压力力，辅辅助助设设备备及及动动力力消消耗耗少少，过过滤滤和和洗洗涤的质量好；涤的质量好；能能分分离离某某些些含含固固形形物物较较少少的的、难难以以过过滤滤的的悬悬浮浮液液或或胶胶体体悬悬浮液，对固形
38、物含量高的悬液也能适用；浮液，对固形物含量高的悬液也能适用；滤饼的含水率低，可洗涤，维修方便；滤饼的含水率低，可洗涤，维修方便；第56页，共67页，编辑于2022年，星期二板框压滤机的缺点是设备笨重，间歇操作，装拆板框板框压滤机的缺点是设备笨重，间歇操作，装拆板框劳动强度大，占地面积多，辅助时间长，生产效率低劳动强度大，占地面积多，辅助时间长，生产效率低。第57页，共67页，编辑于2022年，星期二2）真空转鼓过滤机真空转鼓过滤机真真空空转转鼓鼓过过滤滤机机在在减减压压条条件件下下工工作作，它它的的变变型型很很多多，最最典典型型和和最最常常用用的的是是外外滤滤面面多多室室式式真真空空转鼓过滤机
39、。转鼓过滤机。真真空空转转鼓鼓过过滤滤机机的的过过滤滤面面是是一一个个以以很很低低转转速速旋旋转转的的、开开有有许许多多小小孔孔的的圆圆筒筒(转转鼓鼓)，面面外外覆覆有有金金属属网网及及滤滤布布，将将此此转转鼓鼓置置于于液液槽槽中中，转转鼓鼓内内部部抽抽真真空空，在在滤滤布布上上即即形形成成滤滤饼饼，滤滤液液则则经经中中间间的的管路和分配阀流出管路和分配阀流出.第58页，共67页，编辑于2022年，星期二3）过滤离心过滤离心应用离心力代替压力差作为过滤推动力应用离心力代替压力差作为过滤推动力的分离方法。的分离方法。第59页，共67页，编辑于2022年，星期二2.4.3切向流过滤（切向流过滤（c
40、ross-flowfiltration)是一种维持恒压下高过滤速度的技术。使悬浮液是一种维持恒压下高过滤速度的技术。使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流体的剪切在过滤介质表面作切向流动，利用流体的剪切作用将过滤介质表面的固体移走。作用将过滤介质表面的固体移走。由于生物产品加工要求速度快，过滤滤饼的比阻由于生物产品加工要求速度快，过滤滤饼的比阻力大，切向流过滤比封头过滤（力大，切向流过滤比封头过滤（Dead-endfiltration)优越。优越。几乎所有的用膜进行的生化固液分离都采用切向流的方式。几乎所有的用膜进行的生化固液分离都采用切向流的方式。第60页，共67页，编辑于2022年，星期
41、二2.4.4 2.4.4 脉冲反洗式切向流过滤脉冲反洗式切向流过滤脉冲反洗式切向流过滤脉冲反洗式切向流过滤在切向流过滤的间隙在膜背面加一反压，通过滤液的反透洗掉在切向流过滤的间隙在膜背面加一反压，通过滤液的反透洗掉膜上的固体沉积和膜孔中的堵塞物，使过滤速度加快。膜上的固体沉积和膜孔中的堵塞物，使过滤速度加快。第61页，共67页，编辑于2022年，星期二2.4.5过滤介质的种类及其选择过滤介质的种类及其选择【了解】【了解】(1)无定形颗粒、颗粒活性炭等，可充填于过滤器内作澄无定形颗粒、颗粒活性炭等，可充填于过滤器内作澄清过滤用。清过滤用。(2)成形颗粒：烧结金属、烧结塑料等，做成圆筒形或成形颗粒
42、：烧结金属、烧结塑料等，做成圆筒形或板状用于澄清过滤。板状用于澄清过滤。(3)非金属织布：棉，化学纤维非金属织布：棉，化学纤维(维尼龙、尼龙等维尼龙、尼龙等)、长、长纤维滤布与短纤维滤布纤维滤布与短纤维滤布(4)金属织物：主要用于预涂层的场合金属织物：主要用于预涂层的场合(5)无纺布等：纸、毡、石棉板以及合成纤维无纺布等，无纺布等：纸、毡、石棉板以及合成纤维无纺布等，大多用精密过滤大多用精密过滤第62页，共67页，编辑于2022年，星期二2.4 双水相萃取双水相萃取生化固液分离中最困难的操作是从细胞破碎后的浆液生化固液分离中最困难的操作是从细胞破碎后的浆液中移走细胞碎片，这些碎片分布很广（中移
43、走细胞碎片，这些碎片分布很广（0.21m)，包括（，包括（细细胞壁碎片、膜碎片、完整的胞壁碎片、膜碎片、完整的细细胞器和未破碎胞器和未破碎的的细细胞）。胞）。双水相萃取是水相中加入高分子化合物形成双水相萃取是水相中加入高分子化合物形成密度不同的两相，用于萃取蛋白质。密度不同的两相，用于萃取蛋白质。l膜分离速度慢，易出现膜分离速度慢，易出现污染和蛋白质滞留。污染和蛋白质滞留。l用离心机分离不易除掉用离心机分离不易除掉某些絮状小碎片某些絮状小碎片第63页，共67页，编辑于2022年，星期二2.5 泡沫分离基于表面活性的差异进行分离泡沫分离基于表面活性的差异进行分离表面活性强的物质优先吸附于分散相（
44、气相）表面活性强的物质优先吸附于分散相（气相）与连续相的界面处，被气泡带出连续相而达到与连续相的界面处，被气泡带出连续相而达到浓缩。浓缩。泡沫分离操作简单、耗能低，泡沫分离操作简单、耗能低，适于较低浓度下的分离。适于较低浓度下的分离。原理原理第64页，共67页，编辑于2022年，星期二1）细胞收集或去除）细胞收集或去除 用鼓泡法从发酵液或细胞悬浮液分离细菌和酵母的细胞有较多用鼓泡法从发酵液或细胞悬浮液分离细菌和酵母的细胞有较多的研究，还有一些从培养液中收集孢子、藻类细胞或从废水中的研究，还有一些从培养液中收集孢子、藻类细胞或从废水中除去微生物细胞的报道。除去微生物细胞的报道。2）蛋白质和多肽、
45、酶的提取分离）蛋白质和多肽、酶的提取分离 处于研究阶段，未见应用报道处于研究阶段，未见应用报道3）中药有效成分的分离提取）中药有效成分的分离提取 中药含有多种表面活性物质，如蛋白质高分子物质和皂苷类小分子物质。中药含有多种表面活性物质，如蛋白质高分子物质和皂苷类小分子物质。研究表明甘草中的甘草酸可用泡沫分离法加以浓缩。植物细胞培养液中研究表明甘草中的甘草酸可用泡沫分离法加以浓缩。植物细胞培养液中的次生代谢产物可用泡沫分离法进行分离浓缩。的次生代谢产物可用泡沫分离法进行分离浓缩。应用：在生物技术领域主要用于细胞收集或去除、蛋白质应用：在生物技术领域主要用于细胞收集或去除、蛋白质和酶的提取及天然产
46、物的浓缩和分离。和酶的提取及天然产物的浓缩和分离。第65页，共67页，编辑于2022年，星期二发酵液的预处理发酵液的预处理预处理的目的预处理的目的预处理的具体方法预处理的具体方法一些杂质物质去除的具体方法一些杂质物质去除的具体方法离心沉降离心沉降离心沉降速度离心沉降速度离心沉降溶质完全沉淀所需的时间离心沉降溶质完全沉淀所需的时间沉降系数沉降系数分离因数分离因数离心分离方法离心分离方法差速离心差速离心区带离心区带离心差速区带离心差速区带离心平衡区带离心平衡区带离心离心分离设备及处理能力离心分离设备及处理能力蝶片式离心机蝶片式离心机管式离心机管式离心机总结第66页，共67页，编辑于2022年，星期二泡沫分离泡沫分离双水相萃取双水相萃取过滤离心过滤离心过滤过滤切向流过滤切向流过滤脉冲反洗式切向流过滤脉冲反洗式切向流过滤第67页，共67页，编辑于2022年，星期二