《课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (12).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (12).ppt（32页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌能利用尿素的原因、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2+H+H2 2O COO CO2 2+2NH+2NH3 3细菌脲酶细菌脲酶细菌脲酶细菌脲酶3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽
2、孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌统计统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术启示：寻找启示：寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境的时要根据它对生存环境的要求，到要求，到相应的环境相应的环境中去寻找。中去寻找。
3、原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶多聚酶链式反应链式反应是一是一种在种在体外将少量体外将少量DNADNA大量大量复制复制(PCR)(PCR)的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株方法：方法：抑制大多数微生物的生长抑制大多数微生物的生长 促进促进目的菌株目的菌株的生长的生长结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平
4、板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pHpH等等)，同时抑制或阻止其他微生，同时抑制或阻止其他微生物生长。物生长。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿
5、素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素，只，只，只，只有能合成有能合成有能合成有能合成脲酶脲酶脲酶脲酶的微生物才的微生物才的微生物才的微生物才能分解尿素，以尿素作为能分解尿素，以尿素作为能分解尿素，以尿素作为能分解尿素，以尿素作为氮源。氮源。氮源。氮源。缺乏缺乏缺乏缺乏脲酶的微生物脲酶的微生物脲酶的微生物脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺
6、乏由于不能分解尿素，缺乏由于不能分解尿素，缺乏由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿素的微生物。素的微生物。素的微生物。素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理（1 1）将土壤中的固氮菌分离出来）将土壤中的固氮菌分离出来（2 2）将土壤中自养微生物分离出来）将土壤中自养微生物分离出来举一反三举一反
7、三（3 3）筛选出抗青霉素的微生物）筛选出抗青霉素的微生物（4 4）筛选出耐高浓度食盐的微生物）筛选出耐高浓度食盐的微生物允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基1 1、利用尿素作为唯一氮源的培养基、利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物分离出的微生物只是一种细菌吗？只是一种细菌吗？都是能分解尿素的微生物吗？都是能分解尿素的微生物吗？思考：思考：不是，有多种。不是，有多种。芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，
8、氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。某些真菌和放线菌也能分解尿素。不一定。因为有些微生物可以利用不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。因此，还需借助生物化学方法因此，还需借助生物化学方法对分离的细菌作进一步的鉴定。对分离的细菌作进一步的鉴定。2 2、请你提供一种方法，判断分解、请你提供一种方法，判断分解尿素的细菌确实能将尿素分解成氨。尿素的细菌确实能将尿素分解成氨。思考：思考：方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂中加入酚红指示剂,接种培养该细菌，若接种培养该细菌
9、，若指示剂变红，说明该种菌分解了尿素。指示剂变红，说明该种菌分解了尿素。任务任务2 2：统计每克土壤样品中究竟含有多少统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？这样的细菌？计数法计数法显微镜直接计数法显微镜直接计数法稀释涂布平板法稀释涂布平板法.统计菌落数目：统计菌落数目：1.1.显微镜直接计数法：显微镜直接计数法：这种方法是利用特定这种方法是利用特定这种方法是利用特定这种方法是利用特定细菌计数细菌计数细菌计数细菌计数板或血细胞计数板板或血细胞计数板板或血细胞计数板板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中，在显微镜下计算一定容积里样品中，在显微镜下计算一定容积里样品中，在显微镜下计算一
10、定容积里样品中微生物的数量。微生物的数量。微生物的数量。微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数40040040040010000100001000010000稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数2.2.活菌计数法活菌计数法-稀释涂布平板法稀释涂布平板法原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的
11、一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。说明设置重复组的重要性。在在设设计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性。在在分分析析
12、实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的重重复复组组的的结结果果是是否否一一致致，结结果果不不一一致致，意意味味着着操操作作有有误误，需需要要重新实验重新实验。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平板中个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。计算公式：计算公式：每克样品中的菌
13、株数每克样品中的菌株数 =（C CV V）M M某同学在稀释倍数为某同学在稀释倍数为10106 6 的培养基中测得的培养基中测得平板上菌落数的平均数为平板上菌落数的平均数为234234，那么每克样，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为的体积为0.1ml0.1ml）()()A.2.34A.2.3410108 8B.2.34B.2.3410109 9C.234C.234D.23.4 D.23.4 B（三）设置对照（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断
14、选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。观察菌落数目。主要目的是主要目的是:排除实验组中非测试因素对实验排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的稀
15、释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学由其他同学用与用与A A同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受
16、到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。从从从从肥肥肥肥沃沃沃沃、酸酸酸酸碱碱碱碱度度度度接接接接近近近近中中中中性性性性的的的的湿湿湿湿润润润润土土土土壤壤壤壤中中中中取取取取样样样样。先先先先铲铲铲铲去去去去表表表表层层层层土土土土3cm3cm3cm3cm左左左左右右右右，再再再再取取取取样样样样，将将将将样样样样品品品品装装装装入入入入事事事事先先先先准准准准备备备备好的信封中。好的信封中。好
17、的信封中。好的信封中。“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”一一 土壤取样土壤取样数量最大、种类最多数量最大、种类最多大约大约70%70%90%90%是细菌是细菌取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。二二 制备培养基制备培养基 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：选择了一个较为
18、宽泛的范围：选择了一个较为宽泛的范围：选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为稀释倍数为稀释倍数为101010103 3 3 3101010107 7 7 7。准备准备准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和和和选择培养基。选择培养基。选择培养基。选择培养基。每个稀每个稀每个稀每个稀释度下需要释度下需要释度下需要释度下需要3 3 3 3个选择培养基，个选择培养基，个选择培养基，个选择培养基，1 1 1 1个牛肉膏蛋白胨培养基。个牛肉膏蛋白胨培养基。个牛肉膏蛋白胨培养基。个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要还需要还需要还需要8 8 8 8个灭菌试管和个灭
19、菌试管和个灭菌试管和个灭菌试管和1 1 1 1个灭菌移液管个灭菌移液管个灭菌移液管个灭菌移液管 。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显上生长的菌落数目应明显上生长的菌落数目应明显上生长的菌落数目应明显多于多于多于多于选择培养基上的数目，因选择培养基上的数目，因选择培养基上的数目，因选择培养基上的数目，因此，此，此，此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判
20、断选择牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了培养基是否起到了培养基是否起到了培养基是否起到了选择选择选择选择作用。作用。作用。作用。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因
21、：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在30303030300300300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板（三）（三）样品的稀释样品的稀释问问题题：为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中
22、中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时
23、型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以
24、防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都
25、是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。一一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1 1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2 2 2、应应应应在在在在火火火火焰焰焰焰旁旁旁旁称称称称取取取取土土土土壤壤壤壤。在在在在火火火火焰焰焰焰附附附附近近近近将将将将称称称称好好好好的的的的土土土土样样样样倒倒倒倒入入入入锥锥锥锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3 3 3
26、、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。的稀释度等。的稀释度等。的稀释度等。三三三三 规划时间规划时间规划时间规划时间 三、操作提示三、操作提示四四.结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。