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1、生化分离工程生化分离工程总复习总复习生化分离工程生化分离工程1/28/2023生化分离工程简介生化分离技术：生化分离技术：从含有目标产物的发酵液、酶反应液或从含有目标产物的发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中，提取、精制并加工制动植物细胞培养液中，提取、精制并加工制成高纯度的、符合规定要求的各种产品的技成高纯度的、符合规定要求的各种产品的技术，也称为下游加工技术。术，也称为下游加工技术。生化分离过程的特点：生化分离过程的特点：1 1、产品丰富：产品的多样性导致分离方法的多样性、产品丰富：产品的多样性导致分离方法的多样性2 2、绝大多数生物分离方法来源于化学分离、绝大多数生物分离方法来源于化学分
2、离3 3、生物分离一般比化工分离难度大、生物分离一般比化工分离难度大（1 1）成分复杂）成分复杂（2 2）悬液中的目标产物浓度低）悬液中的目标产物浓度低（3 3）生物活性，条件相对温和）生物活性，条件相对温和（4 4）生物产品要求高质量）生物产品要求高质量（5 5）获得高纯度的干燥产品）获得高纯度的干燥产品（6 6）卫生）卫生发酵液预处理（加热、调pH、絮凝）收集上清液或蛋白质包含体细胞分离（沉降、离心、过滤）细胞碎片分离（离心、过滤、萃取）细胞破碎（高压匀浆、研磨、溶菌处理）初步纯化（沉淀、吸附、萃取、超滤）高度纯化（亲和分离、层析、电泳、结晶）成品加工（超滤、结晶、干燥）细胞清液（含胞外产
3、品）灭活处理细胞生化分离的一般流程 发酵液的预处理和固液分离发酵液的预处理和固液分离 经过加热、调经过加热、调pH、添加絮凝剂等方法对发酵液进行、添加絮凝剂等方法对发酵液进行预处理后，经常采用预处理后，经常采用过滤过滤和和离心离心这两个单元操作进行固液这两个单元操作进行固液分离。如果产品在细胞内，那么这一步中往往还包括细胞分离。如果产品在细胞内，那么这一步中往往还包括细胞的破碎以释放产品操作，这个过程通常是在进行固液分离的破碎以释放产品操作，这个过程通常是在进行固液分离之后进行的，这样可以减少分离体系的体积之后进行的，这样可以减少分离体系的体积(相应增加产相应增加产品浓度品浓度)。由于产品释放
4、之后体系中又同时存在有固体和。由于产品释放之后体系中又同时存在有固体和可溶物（产品），因此需要再增加一步固液分离以除去细可溶物（产品），因此需要再增加一步固液分离以除去细胞碎片。胞碎片。降低液体黏度降低液体黏度 调节调节pH值值 凝聚和絮凝凝聚和絮凝 使用惰性助滤剂使用惰性助滤剂 使用反应剂使用反应剂发酵液预处理的方法发酵液预处理的方法加热加热加水稀释加水稀释典型过滤设备典型过滤设备：-板框过滤机板框过滤机-真空转鼓过滤机真空转鼓过滤机固液分离固液分离-过滤过滤或离心或离心离心设备：离心设备：碟片式离心机碟片式离心机 管式离心机管式离心机 倾析式离心机倾析式离心机常用过滤设备常用过滤设备广泛应
5、用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量固体含量1-10%的悬浮液的分离。的悬浮液的分离。（2）板框过滤机）板框过滤机 这个阶段的主要任务是去除（或收集）这个阶段的主要任务是去除（或收集）发酵液中的固相物质，为后续的几个过程提发酵液中的固相物质，为后续的几个过程提供澄清的原料液体。经过这一步操作，产物供澄清的原料液体。经过这一步操作，产物的浓度或品质一般不会有太大的改善。的浓度或品质一般不会有太大的改善。板框过滤机离心机细胞破碎技术细胞破碎技术机械法机械法非机械法非
6、机械法破碎方法破碎方法高压匀浆高压匀浆珠磨法珠磨法超声破碎超声破碎渗透渗透干燥处理干燥处理酶溶法酶溶法化学法化学法冻融冻融初步纯化（提取）初步纯化（提取）在这一步中，需要除去与目标产物性质差异在这一步中，需要除去与目标产物性质差异较大的杂质并对产品进行浓缩。对于不同性质产较大的杂质并对产品进行浓缩。对于不同性质产品，根据其各自的特点采用不同的方法进行分离，品，根据其各自的特点采用不同的方法进行分离，沉淀、吸附和萃取沉淀、吸附和萃取是这个步骤中的典型操作。这是这个步骤中的典型操作。这个步骤往往是由许多个单元操作组合起来的多级个步骤往往是由许多个单元操作组合起来的多级加工过程，经过处理，产品的浓度
7、（或纯度）有加工过程，经过处理，产品的浓度（或纯度）有较大变化。较大变化。超临界流体萃取树脂吸附萃取技术萃取技术溶剂萃取溶剂萃取（液（液-液萃取）：乳化现象液萃取）：乳化现象液液-固萃取固萃取（浸取）：相似相容（浸取）：相似相容双水相萃取双水相萃取：超临界萃取超临界萃取：升温，降压，密度变小，：升温，降压，密度变小，溶解度变小溶解度变小反胶团萃取反胶团萃取破乳方法破乳方法 发酵液过滤或沉淀发酵液过滤或沉淀 加热加热 稀释法稀释法 加电解质加电解质 转型法转型法 顶替法顶替法沉淀技术沉淀技术盐析沉淀：盐析沉淀：最常用最常用(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4，次常用，次常用NaNa2 2SO
8、SO4 4有机溶剂沉淀：有机溶剂沉淀：丙酮、乙醇，易变性丙酮、乙醇，易变性等电点沉淀等电点沉淀 离子交换树脂由离子交换树脂由骨架骨架、活性基团活性基团和和可可交换离子交换离子组成。组成。阳离子树脂：阳离子树脂：能与带正电的蛋白质结合阴离子树脂：阴离子树脂：能与带负电的蛋白质结合吸附与离子交换技术吸附与离子交换技术离子交换操作过程离子交换操作过程树脂预处理树脂预处理离子交换过程离子交换过程洗脱过程：洗脱过程：洗脱方法有洗脱方法有pH梯度梯度和和盐梯度盐梯度树脂的再生树脂的再生五、应用实例五、应用实例软水制备：软水制备：利用钠型磺酸树脂除去水中的钙离子和利用钠型磺酸树脂除去水中的钙离子和镁离子等碱
9、金属后即可制得软水。镁离子等碱金属后即可制得软水。无盐水制备：无盐水制备：将原水通过氢型强酸性阳离子交换树将原水通过氢型强酸性阳离子交换树脂和羟型强碱或弱碱性阴离子交换树脂的组合，经脂和羟型强碱或弱碱性阴离子交换树脂的组合，经过离子交换反应，将水中所有的阴、阳离子除去，过离子交换反应，将水中所有的阴、阳离子除去，从而制得纯度很高的无盐纯水。从而制得纯度很高的无盐纯水。膜分离技术膜分离技术微滤膜微滤膜的孔径大小在的孔径大小在0.025-14m之间之间超滤膜超滤膜孔的大小在孔的大小在120nm之间之间反渗透膜反渗透膜（截留物质是低分子量的溶质如抗生素、蔗糖（截留物质是低分子量的溶质如抗生素、蔗糖和
10、盐类）和盐类）孔径范围孔径范围0.1-10nm纳滤膜，纳滤膜，平均孔径为平均孔径为2nm。膜的分类膜的分类高度纯化（精制）高度纯化（精制）这步中所用得技术对产品的针对性（选择性）这步中所用得技术对产品的针对性（选择性）较强，能够除去与产品的物理性质或化学功能类似较强，能够除去与产品的物理性质或化学功能类似的一些杂质。的一些杂质。色谱、电泳、结晶色谱、电泳、结晶是很好的一些纯化是很好的一些纯化方法，产品的品质也能得到很大的提高。方法，产品的品质也能得到很大的提高。结晶层析色谱技术（层析技术）吸附色谱离子交换色谱凝胶过滤色谱：分子量大小差异疏水作用色谱：高浓度盐溶液亲和色谱：酶和底物的专一性凝胶过
11、滤色谱分子筛色谱，体积排阻色谱原理：利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于凝当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于凝胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便随着溶剂在胶胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便随着溶剂在胶粒间隙向下移动并最先流出柱外；直径小于凝胶孔径的分粒间隙向下移动并最先流出柱外；直径小于凝胶孔径的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样不同大小的子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样不同大小的分子由于所经的路径不同从而得到分离，分子由于所经的路径不同从而得到分离，大分子物
12、质先被大分子物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。凝胶层析凝胶层析的应用的应用 脱盐分离提纯测定高分子物质的分子量高分子溶液的浓缩蛋白质复性研究柱层析操作过程柱层析操作过程（1 1）装柱）装柱：干法装柱干法装柱 湿法装柱湿法装柱 注意：湿法装柱中柱内预留一部分水，防止气泡的产生，装柱注意：湿法装柱中柱内预留一部分水，防止气泡的产生，装柱过程要连贯。平衡。过程要连贯。平衡。（2 2）加样）加样：干法加样干法加样 湿法加样湿法加样 注意：加样过程中，要防止产生飞溅，量要适中。注意：加样过程中，要防止产生飞溅，量要适中。（3 3）洗脱）洗脱：以设定好的流速加入洗脱
13、剂，可以是单一溶剂，也可以：以设定好的流速加入洗脱剂，可以是单一溶剂，也可以梯度洗脱。梯度洗脱。注意：不使柱表面的溶液流干，柱上端保留一层溶液。注意：不使柱表面的溶液流干，柱上端保留一层溶液。（4 4）收集）收集：每隔：每隔10mL10mL收集一试管，使用层析的手段或紫外检测器进收集一试管，使用层析的手段或紫外检测器进行实时的检测，合并具有相同物质的流份。行实时的检测，合并具有相同物质的流份。电泳技术SDS-PAGE电泳：测定蛋白质分子量等电聚焦电泳：测蛋白质等电点成品加工成品加工 根据产品应用时的要求，在产物经过提取和根据产品应用时的要求，在产物经过提取和精制后，一般还需要一些加工步骤。例如
14、浓缩、精制后，一般还需要一些加工步骤。例如浓缩、无菌过滤和去热原、无菌过滤和去热原、干燥干燥、加入稳定剂等。、加入稳定剂等。膜分离（浓缩、去热原）冷冻干燥机干燥技术干燥技术针对热敏性物质开发的单元操作有：针对热敏性物质开发的单元操作有：瞬时快速干燥瞬时快速干燥瞬时快速干燥瞬时快速干燥：接触时间短、气流温度高：接触时间短、气流温度高：接触时间短、气流温度高：接触时间短、气流温度高 喷雾干燥喷雾干燥喷雾干燥喷雾干燥：时间短、热效低、可同时造粒：时间短、热效低、可同时造粒：时间短、热效低、可同时造粒：时间短、热效低、可同时造粒 气流干燥气流干燥气流干燥气流干燥：接触时间较长：接触时间较长：接触时间较
15、长：接触时间较长 沸腾干燥沸腾干燥沸腾干燥沸腾干燥：接触时间最长，热效最高：接触时间最长，热效最高：接触时间最长，热效最高：接触时间最长，热效最高 冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥：适用于粘稠状物料，活性保持最好：适用于粘稠状物料，活性保持最好：适用于粘稠状物料，活性保持最好：适用于粘稠状物料，活性保持最好 微波干燥微波干燥微波干燥微波干燥：时间短，效率高：时间短，效率高：时间短，效率高：时间短，效率高 红外干燥红外干燥红外干燥红外干燥：温度高，干燥速度快：温度高，干燥速度快：温度高，干燥速度快：温度高，干燥速度快 抗生素的生产过程是一个典型的生化分离过抗生素的生产过程是一个典型的生化分离过程，包括以上四个步骤，如表程，包括以上四个步骤，如表3所示。产品的浓度所示。产品的浓度在分离（初步纯化）过程中增加幅度最大，但产在分离（初步纯化）过程中增加幅度最大，但产品的纯度却是在纯化过程中提高最多。品的纯度却是在纯化过程中提高最多。表3 典型生物制品分离过程示例步 骤典型过程产 品浓度（克/升）纯度（）发酵液获得去除不溶物分离纯化精制发酵过滤萃取色谱结晶0.1-51.0-55-5050-20050-2000.1-1.00.2-2.01-1050-8090-100