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1、生化分离工程生化分离工程复习复习n据据各各种种资资料料统统计计，分分离离纯纯化化过过程程所所需需的的费费用用要要占占产产品品总总成成本的很大比例，按产品不同。本的很大比例，按产品不同。n对对抗抗生生素素生生产产而而言言，分分离离纯纯化化部部分分的的投投资资费费用用约约为为发发酵酵部部分分的的4倍倍；对对有有机机酸酸或或氨氨基基酸酸生生产产而而言言，则则为为倍倍；对对基基因因工工程程药药物物，分分离离纯纯化化技技术术的的要要求求更更高高，如如重重组组DNA蛋蛋白白质质精精制制的的费费用用可可占占整整个个生生产产费费用用的的8090%；对对于于血血液液制制品品，分离纯化几乎占整个生产费用的分离纯化
2、几乎占整个生产费用的100%。n因因此此人人们们逐逐渐渐认认识识到到下下游游工工程程的的落落后后有有可可能能会会阻阻碍碍生生物物技技术的发展。术的发展。一、一、分离纯化的一般步骤分离纯化的一般步骤n(1)发酵液的预处理和固液分离发酵液的预处理和固液分离；n(2)初步分离初步分离(提取提取)；n(3)高度纯化高度纯化(精制精制)；n(4)成品加工。成品加工。二、多肽和蛋白质的纯化二、多肽和蛋白质的纯化n多肽和蛋白质的纯化包括两部分内容。多肽和蛋白质的纯化包括两部分内容。n一是将蛋白质与非蛋白质分开，二是将不同的蛋白质分开。一是将蛋白质与非蛋白质分开，二是将不同的蛋白质分开。n对对非非蛋蛋白白部部
3、分分可可以以根根据据其其性性质质采采用用适适当当的的方方法法去去除除。而而对对于于不不同同蛋蛋白白质的分离则可以利用它们之间性质上的差异进行。常用的方法有质的分离则可以利用它们之间性质上的差异进行。常用的方法有:n(一一)利利用用溶溶解解度度不不同同的的纯纯化化方方法法 有有盐盐析析法法、有有机机溶溶剂剂法法、等等电电点点沉沉淀淀法、加热变性法等。法、加热变性法等。n(二二)利用分子形状和大小不同的纯化方法利用分子形状和大小不同的纯化方法 凝胶层析法、透析法等。凝胶层析法、透析法等。n(三三)利用电离性质不同的纯化方法利用电离性质不同的纯化方法 离子交换法、电泳法等。离子交换法、电泳法等。n(
4、四四)利用生物功能专一性的不同纯化蛋白质利用生物功能专一性的不同纯化蛋白质 亲和层析法等。亲和层析法等。三、蛋白质分离纯化举例三、蛋白质分离纯化举例 n3.1 重组人粒细胞重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子n人人粒粒细细胞胞-巨巨噬噬细细胞胞集集落落刺刺激激因因子子（human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）是是一一种种可可由由体体内内多多种种细细胞胞产产生生的的细细胞胞因因子子，如如激激活活的的T、B淋淋巴巴细细胞胞、成成纤纤维维细细胞胞、内内皮皮细细胞胞等等，可可作作用用于于造造血血干干细
5、细胞胞，促促进进其其增增殖殖、分分化化，形形成成中中性性粒粒细细胞胞和和巨巨噬噬细细胞胞群群，同同时时还还能能刺刺激激噬噬酸酸性性粒细胞、巨核细胞、多浅能性和早期红细胞的形成和增殖。粒细胞、巨核细胞、多浅能性和早期红细胞的形成和增殖。n 1993年年获获美美国国FDA批批准准重重组组GM-CSF（rhGM-CSF）用用于于临临床床。主主要要用用于于治治疗疗肿肿瘤瘤化化疗疗产产生生的的造造血血障障碍碍、再再生生障障碍碍性性贫贫血、骨髓异常增生综合征等，还用于增强免疫、骨髓移植等。血、骨髓异常增生综合征等，还用于增强免疫、骨髓移植等。3.1.1 GM-CSF的特性的特性n分分泌泌到到细细胞胞外外的
6、的成成熟熟人人由由127个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，分分子子量量为为22kD。n不不同同来来源源的的GM-CSF分分子子量量范范围围为为 35kD，分分子子量量差差异异是是由由糖糖基基化化程程度度不不同同造造成成的的。但但糖糖基基化化程程度度不不同同的的GM-CSF生生物物学学活活性性却却没没有有明明显显的的不不同同，甚甚至至有有报报道道大大肠肠杆杆菌菌表表达达的的非非糖糖基基化化GM-CSF比比真真核核细细胞胞表表达达的的糖糖基基化化GM-CSF具具有更高的生物学活性。有更高的生物学活性。n GM-CSF的的分分子子由由两两个个反反向向平平行行的的 折折叠叠和和四四个个反反向向平平行行
7、的的 螺螺旋旋组组成成，有有两两个个二二硫硫键键分分别别连连接接螺螺旋旋B和和 折折叠叠的的第第二条链、螺旋二条链、螺旋C和羧基末端。和羧基末端。nrhGM-CSF的的pI为。为。3.1.2 GM-CSF的分离和纯化的分离和纯化n本例是以包涵体的形式进行表达的。本例是以包涵体的形式进行表达的。nI)收集菌体细胞收集菌体细胞 n 发发酵酵后后的的工工程程菌菌以以7000r/min离离心心30min，用用50mmol/L Tris-盐酸缓冲液反复洗涤、离心盐酸缓冲液反复洗涤、离心3次，去上清液。次，去上清液。nII)细胞破碎与包涵体的收集细胞破碎与包涵体的收集n 沉沉淀淀（菌菌体体细细胞胞）加加4
8、倍倍体体积积20mmol/L磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液(含含5mmol/L EDTA)，冷冷浴浴搅搅匀匀，置置超超声声破破碎碎器器中中破破菌菌，每每次次30s，间间隔隔30s，反反复复破破碎碎直直至至革革兰兰染染色色镜镜检检无无完完整整的的菌菌体体止止。5000 g离心离心30min，去上清，沉淀即含有包涵体。，去上清，沉淀即含有包涵体。3.1.2 GM-CSF的分离和纯化的分离和纯化nIII)包涵体包涵体的洗涤的洗涤n上上 述述 沉沉 淀淀 加加 入入 9倍倍 体体 积积 20mmol/L磷磷 酸酸 盐盐 缓缓 冲冲 液液(含含0.5%TritonX I00)，5000 g离离心心30min，
9、沉沉淀淀加加入入9倍倍体体积积20mmol/L磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液(含含脲脲)，同同法法离离心心，沉沉淀淀加加入入6倍倍体体 积积 20mmol磷磷 酸酸 盐盐 缓缓 冲冲 液液(含含 5mmol/L EDTA)，以以10000 g离心离心30min，收集沉淀。，收集沉淀。nIV)包涵体的变性与复性包涵体的变性与复性n上上步步沉沉淀淀加加入入8mol/L脲脲溶溶液液，振振摇摇l2h，40000 g离离心心30min。用用逐逐步步稀稀释释法法将将上上清清液液脲脲浓浓度度稀稀释释至至，复复性性24h，以以17000 g离离心心30min，上上清清液液即即为为复复性性的的rhGM-CSF粗粗产品
10、。产品。3.1.2 GM-CSF的分离和纯化的分离和纯化nV)色谱法纯化色谱法纯化 nV-I）疏水色谱）疏水色谱 n 将将 Phenyl-Sepharose 6 FF色色 谱谱 柱柱 用用 50mmol/L磷磷 酸酸-7%（NH4)2SO4液液(pH6.9)平衡。平衡。n 复性粗产品加入（复性粗产品加入（NH4)2SO4 使其浓度达使其浓度达7%(w/v)，上样。，上样。n 用用50mmol/L磷磷酸酸-7%（NH4)2SO4液液(pH6.9)、20mmol磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液（）及及30%异异丙丙醇醇依依次次洗洗脱脱，280nm紫紫外外检检测测，收集洗脱峰，电泳（银染色）检定。收集洗脱峰
11、，电泳（银染色）检定。3.1.2 GM-CSF的分离和纯化的分离和纯化nV-II）离子交换色谱）离子交换色谱 n装装DEAE-Sepharose FF色色谱谱柱柱，以以20mmol/L磷磷酸酸盐缓冲液盐缓冲液(pH6.5)平衡至基线。平衡至基线。n加加上上步步得得到到的的目目的的产产物物，以以20mmol/L磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液(pH6.5)、20mmol/L磷磷酸酸盐盐-NaCl液液(pH6.5)、20mmol/L磷磷酸酸盐盐-lmol/L NaCl液液(pH6.4)分分别别洗洗脱脱，收集洗脱峰，电泳检定。收集洗脱峰，电泳检定。3.1.2 GM-CSF的分离和纯化的分离和纯化nV-III
12、）凝胶色谱）凝胶色谱 n 装装Sephacryl S 200色色谱谱柱柱，以以20mmol/L磷磷酸酸盐盐液液(pH6.5)平平衡衡，上上步步目目的的产产物物上上样样后后以以相相同同的的缓缓冲液进行洗脱，收集吸收峰，产品经冲液进行洗脱，收集吸收峰，产品经 m滤膜过滤。滤膜过滤。n本本法法所所得得rhGM-CSF产产品品，经经HPLC检检测测为为单单一一峰峰，纯纯度度为为99%；SDS-PAGE显显示示为为一一条条带带，分分子量为子量为14kD；生物活性为；生物活性为 107 107u/mg3.2 人神经细胞生长因子人神经细胞生长因子n神神经经生生长长因因子子（nerve growth fact
13、or,NGF）是是神神经经系系统统最最重重要要的的生生物物活活性性分分子子之之一一，也也是是最最早早发发现现和和最最典典型型的的神神经经营营养养因因子子，它它们们影影响响外外周周神神经经及及中中枢枢神神经经系系统统某某些些神神经经元元的的存存活活与与分分化化，可可促促进进损损伤伤神神经经系系统统的再生与修复。的再生与修复。nNGF还具有免疫调节作用。还具有免疫调节作用。3.2.1 NGF的特性的特性 n人人NGF（hNGF）的的前前肽肽原原含含241个个氨氨基基酸酸残基，信号肽为残基，信号肽为18个氨基酸残基。个氨基酸残基。n 成成熟熟hNGF为为l20个个氨氨基基酸酸残残基基，分分子子量量为
14、为，有有1个个N-糖糖基基化化位位点点，6个个Cys残残基基，形形成成3个链内二硫键，个链内二硫键，pI为。为。n 在体内以二聚体存在。在体内以二聚体存在。3.2.2 分离纯化分离纯化n本例是以人胎盘为原料提取本例是以人胎盘为原料提取hNGF。n I).胎盘绒毛的分离胎盘绒毛的分离 n 取取人人足足月月胎胎盘盘，用用注注射射器器向向脐脐带带总总动动脉脉注注入入生生理理盐盐水水，并并轻轻揉揉胎胎盘盘，直直至至洗洗尽尽血血污污，分离绒毛叶。分离绒毛叶。3.2.2 分离纯化分离纯化 II)提取提取n将将 来来 自自 100个个 胎胎 盘盘 的的 绒绒 毛毛 叶叶 28kg剪剪 碎碎，加加20%（v/
15、w）预预冷冷的的，含含lmmol/L EDTA)，匀匀浆浆，每次每次3min，共，共3次。次。n 匀匀浆浆液液在在4 C 8000r/min离离心心30min，上上清清以以尼尼龙龙膜过滤，除去脂肪。膜过滤，除去脂肪。n滤滤液液中中加加尿尿素素至至5mol/L，并并调调pH至至，静静置置2h，以以解解离离hNGF高高分分子子聚聚合合体体。8000r/min离离心心30min，收集上清液。，收集上清液。3.2.2 分离纯化分离纯化 III)超滤分离超滤分离n上上清清液液以以分分子子量量截截留留值值为为30kD的的超超滤滤膜膜超超滤滤，滤滤液液再再用用10kD的的超超滤滤膜膜超超滤滤，当当截截留留液
16、液剩剩下下约约1000ml时时，在在其其中中加加、50mmol/L NaAc-HAc(含含0.4mol/L NaCl)缓缓冲冲液液(平平衡衡缓缓冲冲液液)2000ml，再再浓浓缩缩至至1000ml，反反复复5次次，收集截留液，对平衡缓冲液充分透析。收集截留液，对平衡缓冲液充分透析。3.2.2 分离纯化分离纯化 IV)离子交换色谱纯化离子交换色谱纯化n透透析析液液上上预预先先以以平平衡衡缓缓冲冲液液平平衡衡的的CM52离离子子交交换换纤纤维维素素 30cm)柱柱，上上完完样样后后以以平平衡衡缓缓冲冲液液洗洗脱脱穿穿过过峰峰，换换用用、50mmol/L Tris-盐盐酸酸缓缓冲冲液液洗洗脱脱，最最
17、后后以以、含含的的50mmol/L Tris-盐盐酸酸缓缓冲冲液液洗洗脱脱，收收集集洗洗脱峰脱峰(含含hNGF)。n本本制制备备工工艺艺从从100个个胎胎盘盘可可提提取取纯纯化化得得hNGF约约，比比活活约约为为15000u/mg；产产品品经经SDS-PAGE银银染染显显示示其其分分子子量量约约，为为单单一一条条带带；经经TSK2000SW HPLC层层析得到单一峰。析得到单一峰。包涵体包涵体n多多数数重重组组蛋蛋白白表表达达产产物物是是以以不不溶溶性性表表达达产产物物存存在在于于细细胞胞内内的的，这这种种不不溶溶性性表表达达产产物物称称为为包包涵涵体体。这类产物的分离制备相对较复杂。这类产物
18、的分离制备相对较复杂。n包包涵涵体体基基本本上上由由蛋蛋白白质质组组成成，其其中中大大部部分分是是克克隆隆基基因因表表达达产产物物，因因无无正正确确折折叠叠的的立立体体结结构构而而没没有有活活性性。其其它它成成分分有有细细胞胞RNA聚聚合合酶酶、膜膜蛋蛋白白、核核糖糖体体RNA、质质粒粒DNA和和质质粒粒编编码码蛋蛋白白以以及及脂脂质质、肽聚糖、脂多糖等。肽聚糖、脂多糖等。(1)包涵体的制备与处理包涵体的制备与处理n包包涵涵体体的的制制备备主主要要包包括括菌菌体体细细胞胞的的破破碎碎与与包包涵体的洗涤与收集涵体的洗涤与收集两步。两步。n菌菌体体的的破破碎碎可可用用前前面面所所述述的的各各种种方
19、方法法，如如超超声波法。声波法。n包包涵涵体体的的洗洗涤涤与与收收集集一一般般采采用用含含不不同同添添加加剂剂的磷酸盐缓冲液通过离心进行，收集沉淀。的磷酸盐缓冲液通过离心进行，收集沉淀。(2)从包涵体中获取活性蛋白从包涵体中获取活性蛋白n从从包包涵涵体体中中获获取取活活性性蛋蛋白白，需需要要对对其其进进行行处处理理。对对包包涵涵体体产物的处理包括三个步骤：产物的处理包括三个步骤：n包涵体溶解前处理包涵体溶解前处理n在在变变性性条条件件下下溶溶解解包包涵涵体体可可将将表表达达产产物物变变为为可可溶溶形形式式，以以利于分离纯化。利于分离纯化。n在在溶溶解解包包涵涵体体前前，先先用用温温和和表表面面
20、活活性性剂剂(如如Triton X-100)或或低低浓浓度度弱弱变变性性剂剂(如如尿尿素素)处处理理，除除去去脂脂质质和和部部分分膜膜蛋蛋白白，使用浓度以不溶解包涵体中的表达产物为原则。使用浓度以不溶解包涵体中的表达产物为原则。(2)从包涵体中获取活性蛋白从包涵体中获取活性蛋白n包涵体溶解和表达产物变性包涵体溶解和表达产物变性n溶溶解解包包涵涵体体通通常常使使用用变变性性剂剂盐盐酸酸胍胍和和尿尿素素以以及及表表面活性剂面活性剂SDS。这三种试剂溶解包涵体原理不同。这三种试剂溶解包涵体原理不同。n盐盐酸酸胍胍和和尿尿素素破破坏坏离离子子间间相相互互作作用用，解解除除维维系系蛋蛋白白质质稳稳定定性
21、性的的非非共共价价键键，引引起起蛋蛋白白质质的的去去折折叠叠和和变性，但它们不破坏共价键；变性，但它们不破坏共价键；nSDS主要破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用主要破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用(2)从包涵体中获取活性蛋白从包涵体中获取活性蛋白n由由于于表表达达产产物物、宿宿主主以以及及培培养养和和诱诱导导条条件件的的差差异异，溶溶解解包包涵涵体体所所用用的的试试剂剂和和浓浓度度也也会会有有很很大大差差异异，一一般般先先进进行行予予试试验验，测测定定包包涵涵体体中中表表达达产产物物开开始始溶解和完全溶解所需试剂浓度及作用时间。溶解和完全溶解所需试剂浓度及作用时间。n一一般般能能使使表表达达产产物
22、物溶溶解解的的盐盐酸酸胍胍浓浓度度为为58mol/L，尿尿素素为为68mol/L，SDS浓浓度度在在l%2%(w/v)之之间间。不不同同溶溶解解剂剂对对层层析析分分离离影影响响不不同同，也也需需要要予予以以关关注。注。(2)从包涵体中获取活性蛋白从包涵体中获取活性蛋白n重组蛋白的复性重组蛋白的复性n 溶溶解解的的包包涵涵体体中中重重组组蛋蛋白白的的复复性性主主要要有有两两种种方方法法：一一是是将将溶溶液液稀稀释释，使使变变性性剂剂浓浓度度变变低低，促促使使蛋蛋白白质质复复性性；另另一一种种方方法是用透析、超滤或电渗析法除去变性剂。法是用透析、超滤或电渗析法除去变性剂。n 包包涵涵体体中中蛋蛋白白质质产产物物如如含含有有两两个个以以上上二二硫硫键键有有可可能能会会发发生生错错误误连连接接。为为此此，在在复复性性之之前前需需用用还还原原剂剂打打断断S-S键键，使使其其变变为为-SH，复复性性后后再再加加入入氧氧化化剂剂使使两两个个-SH形形成成正正确确的的二二硫硫键。键。n常常用用的的还还原原剂剂有有：二二硫硫苏苏糖糖醇醇（DTT）、-巯巯基基乙乙醇醇、还还原原形谷胱甘肽。形谷胱甘肽。n常用的氧化剂有：氧化型谷胱甘肽和空气（在碱性条件下）常用的氧化剂有：氧化型谷胱甘肽和空气（在碱性条件下）。n谢谢大家！