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1、高二生物基因工程的基本操作程序本讲稿第一页，共四十三页课标领航课标领航1阐阐述基因工程的原理。述基因工程的原理。2掌握并理解基因工程的基本操作程序。掌握并理解基因工程的基本操作程序。3尝试设计尝试设计某一某一转转基因生物的研制基因生物的研制过过程。程。【重点】【重点】基因工程的原理及基本操作程序。基因工程的原理及基本操作程序。【难难点】点】基因文基因文库库；PCK扩扩增增过过程；目的基因的程；目的基因的检测检测。本讲稿第二页，共四十三页看看到到这这幅幅图图，联联系系基基因因工工程程，你你有有何何感感想想？让让植植物物和和动动物物合合为为一一体体可可能能不不好好实实现现，但但我我们们能能不不能能
2、通通过过基基因因工工程程技技术术，让让这这一一愿愿望望实实现现呢呢？实实际际上上，基基因因工工程程技技术术已已经经实实现现了了人人们们的的许许多多看看似似异异想想天天开的愿望或构想。开的愿望或构想。情景情景导导航航本讲稿第三页，共四十三页 核心要点突破核心要点突破基础自主梳理基础自主梳理知能过关演练知能过关演练12基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序本讲稿第四页，共四十三页基础自主梳理基础自主梳理一、基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序1目的基因的目的基因的获获取。取。2_的构建。的构建。3将目的基因将目的基因导导入入_。4目的基因的目的基因的检测检测与与鉴鉴定。定。基因表
3、达基因表达载载体体受体受体细细胞胞本讲稿第五页，共四十三页二、目的基因的二、目的基因的获获取取1目的基因：主要是指目的基因：主要是指编码编码_的的结结构基因。构基因。2获获取方法取方法(1)从基因文从基因文库库中中获获取取基基因因文文库库：将将含含有有某某种种生生物物不不同同基基因因的的许许多多_片片段段，导导入入受受体体菌菌的的群群体体中中储储存存，各各个个受受体体菌菌分分别别含含有有这这种生物的不同基因。种生物的不同基因。蛋白蛋白质质DNA本讲稿第六页，共四十三页所有所有本讲稿第七页，共四十三页思考感悟思考感悟1怎怎样样从基因文从基因文库库中得到我中得到我们们需要的目的基因？需要的目的基因
4、？【提示】【提示】可以根据目的基因的有关信息，例如，根可以根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的的位置、基因的转录产转录产物物mRNA，以及基因的翻，以及基因的翻译产译产物蛋白物蛋白质质等特性来等特性来获获取目的基因。取目的基因。本讲稿第八页，共四十三页(2)利用利用PCR技技术扩术扩增目的基因增目的基因含含义义一一项项在生物体外在生物体外_的核酸合成的核酸合成技技术术原理原理 DNA_前提前提条件条件有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这这一一序列合
5、成序列合成_扩扩增增过过程程目的基因目的基因DNA受受热热变变性解旋性解旋为为_引物与引物与单单链链相相应应互互补补序列序列结结合合在在_作用下延作用下延伸伸形成新的形成新的DNA分子分子循循环环重复以指数形式重复以指数形式扩扩增增结结果果 以指数形式以指数形式扩扩增：增：2n复制特定复制特定DNA片段片段双双链链复制复制引物引物单链单链DNA聚合聚合酶酶本讲稿第九页，共四十三页(3)人人工工合合成成法法：如如果果基基因因较较小小，核核苷苷酸酸序序列列又又已已知知，可可以通以通过过DNA合成合成仪仪用化学方法直接人工合成。用化学方法直接人工合成。本讲稿第十页，共四十三页目的基因目的基因目的基因
6、目的基因首端首端RNA聚合聚合酶酶终终止子止子本讲稿第十一页，共四十三页2功功能能：(1)使使目目的的基基因因在在受受体体细细胞胞中中稳稳定定存存在在，并并且可以且可以遗传给遗传给下一代。下一代。(2)使目的基因使目的基因_表达和表达和发挥发挥作用。作用。能能够够本讲稿第十二页，共四十三页思考感悟思考感悟2如何把如何把导导入了目的基因的受体入了目的基因的受体细细胞胞筛选筛选出来？出来？【提示】【提示】以四以四环环素抗性基因素抗性基因为为例，程序如下：例，程序如下：本讲稿第十三页，共四十三页四、将目的基因四、将目的基因导导入受体入受体细细胞胞1转转化化：_进进入入受受体体细细胞胞内内，并并且且在
7、在受受体体细细胞胞内内维维持持稳稳定和定和_的的过过程。程。2导导入植物入植物细细胞胞(1)方法：方法：_、基因、基因枪枪法、花粉管通道法。法、花粉管通道法。(2)农农杆菌特点杆菌特点易感染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。Ti质质粒粒上上的的_可可转转移移至至受受体体细细胞胞，并并且且整整合合到到受体受体细细胞染色体胞染色体DNA上。上。目的基因目的基因表达表达农农杆菌杆菌转转化法化法TDNA本讲稿第十四页，共四十三页3导导入入动动物物细细胞胞(1)方法：方法：_注射技注射技术术。(2)常用受体常用受体细细胞：受精卵。胞：受精卵。4导导入微生物入微生物细细胞胞(1)原原核核生
8、生物物特特点点：繁繁殖殖快快、多多为为_、遗遗传传物物质质相相对较对较少等。少等。(2)对对受受体体细细胞胞的的常常用用处处理理方方法法：用用_处处理理细细胞胞，使使细细胞胞处处于于一一种种能能吸吸收收周周围围环环境境中中DNA分分子子的的生生理理状状态态(这这种种细细胞称胞称为为感受感受态细态细胞胞)。显显微微单细单细胞胞Ca2本讲稿第十五页，共四十三页思考感悟思考感悟3从从细细胞胞器器的的功功能能上上分分析析，若若通通过过基基因因工工程程生生产产人人的的糖糖蛋白，可以用大蛋白，可以用大肠肠杆菌杆菌吗吗？【提示】【提示】不可以，糖蛋白上的糖不可以，糖蛋白上的糖链链是在内是在内质质网和高网和高
9、尔尔基体上加工完成的，而内基体上加工完成的，而内质质网和高网和高尔尔基体存在于真核基体存在于真核细细胞中，大胞中，大肠肠杆菌是原核生物，杆菌是原核生物，细细胞中不含有胞中不含有这这两种两种细细胞器。胞器。本讲稿第十六页，共四十三页五、目的基因的五、目的基因的检测检测与与鉴鉴定定1检测检测及方法及方法(1)检检测测转转基基因因生生物物染染色色体体的的DNA上上是是否否插插入入了了目目的的基基因，采用因，采用DNA分子分子杂杂交技交技术术。(2)检测检测目的基因是否目的基因是否_，采用分子，采用分子杂杂交技交技术术。(3)检检测测目目的的基基因因是是否否_，采采用用抗抗原原抗体抗体杂杂交。交。2鉴
10、鉴定定：除除了了_外外，还还需需要要进进行行个个体体生生物物学学水平的水平的鉴鉴定，如抗虫、抗病定，如抗虫、抗病鉴鉴定等。定等。转录转录出出mRNA翻翻译译成蛋白成蛋白质质分子分子检测检测本讲稿第十七页，共四十三页核心要点突破核心要点突破目的基因的获取目的基因的获取1两种基因文两种基因文库库的主要区的主要区别别如下表如下表文文库类库类型型cDNA文文库库基因基因组组文文库库文文库库大小大小小小大大基因中启基因中启动动子子无无有有基因中内含子基因中内含子无无有有基因多少基因多少部分基因部分基因全部基因全部基因物种物种间间的基因交流的基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以本讲稿第十八页，共四十三
11、页特特别别提提醒醒 细细胞胞中中成成熟熟的的mRNA是是需需要要在在转转录录后后将将非非编编码码区区转转录录出出的的序序列列切切除除的的，只只留留下下编编码码区区序序列列，因因而而从从这这样样的的mRNA反反转转录录来来的的cDNA不不会会有有启启动动子子序序列列。对对于于真真核核生生物物在在转转录录后后的的加加工工过过程程中中还还要要将将内内含含子子部部分分转转录录出出的的序序列列也也切切除除掉掉，所所以以真真核核生生物物的的cDNA中中也也不不会会有有内内含含子子序列。序列。cDNA是反是反转录获转录获得的双得的双链链DNA。生生物物之之间间进进行行基基因因交交流流，只只有有使使用用受受体
12、体生生物物自自身身基基因的启因的启动动子比子比较较有利于基因的表达。有利于基因的表达。通通过过cDNA文文库库获获得得的的目目的的基基因因没没有有启启动动子子，只只将将编编码码序列序列导导入受体生物中无法入受体生物中无法转录转录。本讲稿第十九页，共四十三页2DNA复制、复制、PCR技技术术和基因克隆的比和基因克隆的比较较DNA复制复制PCR技技术术基因克隆基因克隆场场所所细细胞核胞核生物体外生物体外细细胞内胞内酶酶解旋解旋酶酶、DNA聚合聚合酶酶Taq酶酶限制限制酶酶、DNA连连接接酶酶载载体体不需要不需要不需要不需要需要需要遵循原遵循原则则碱基互碱基互补补配配对对碱基互碱基互补补配配对对碱基
13、互碱基互补补配配对对结结果果DNA分子分子DNA分子片分子片段段DNA分子片段分子片段本讲稿第二十页，共四十三页3提取目的基因方法的比提取目的基因方法的比较较途径途径从基因文从基因文库库中直接中直接分离目的基因分离目的基因人工合基因人工合基因(真核真核细细胞胞)方法方法鸟枪鸟枪法法逆逆转录转录法法根据已知氨基根据已知氨基酸序列合成酸序列合成DNA本讲稿第二十一页，共四十三页途径途径从基因文从基因文库库中直中直接分离目的基因接分离目的基因人工合基因人工合基因(真核真核细细胞胞)过过程程供体供体细细胞中的胞中的DNA限制限制酶酶许许多多DNA片段片段连连接接表达表达载载体体导导入入受体受体细细胞胞
14、外源外源DNA扩扩增，增，产产生特定性状生特定性状分离分离目的基因目的基因目的基因的目的基因的mRNA 逆逆转录转录单链单链DNA合成合成双双链链DNA(即目的基因即目的基因)蛋白蛋白质质的氨基的氨基酸序列酸序列推推测测mRNA的核苷的核苷酸序列酸序列推推测测结结构基因的核构基因的核苷酸序列苷酸序列 化学合成化学合成目的基因目的基因本讲稿第二十二页，共四十三页途径途径从基因文从基因文库库中中直接分离目的直接分离目的基因基因人工合基因人工合基因(真核真核细细胞胞)优优点点操作操作简单简单专专一性一性强强专专一性一性强强，可，可产产生自然界不生自然界不存在的新基因存在的新基因缺点缺点工作量大，盲工
15、作量大，盲目性大，目性大，专专一一性差性差操作操作过过程程较较复复杂杂，技，技术术要求要求过过高高适用范适用范围围狭小狭小本讲稿第二十三页，共四十三页 1970年年，特特明明和和巴巴尔尔的的摩摩证证实实了了RNA病病毒毒能能依依赖赖RNA合合成成DNA的的过过程程，并并发发现现了了催催化化此此过过程程的的酶酶。下下面面为为形形成成cDNA的的过过程程和和PCR扩扩增增过过程程示示意意图图。请请根根据据图图解回答下列解回答下列问题问题：例例例例1 1本讲稿第二十四页，共四十三页(1)催催化化过过程程的的酶酶是是_；核核酸酸酶酶H的的作作用用是是_。(2)过过程程也也称称为为DNA的的变变性性，此
16、此过过程程在在温温度度高高达达9095 时时才能完成，才能完成，说说明明DNA分子具有分子具有_性。性。(3)由由图图中中信信息息分分析析可可知知，催催化化过过程程的的酶酶都都是是_，两两 者者 在在 作作 用用 特特 性性 上上 的的 区区 别别 是是_。(4)如如果果RNA单单链链中中有有碱碱基基100个个，其其中中A占占25%，U占占15%，则则通通过过该该过过程程合合成成的的一一个个双双链链DNA片片段段中中有有胞胞嘧啶嘧啶_个。个。本讲稿第二十五页，共四十三页【尝尝试试解解答答】(1)反反转转录录酶酶(或或逆逆转转录录酶酶)分分解解RNA(2)稳稳定定(3)DNA聚合聚合酶酶催化催化
17、过过程的程的酶酶耐高温耐高温(4)60本讲稿第二十六页，共四十三页【解解析析】根根据据图图示示可可以以看看出出，该该过过程程是是RNA在在逆逆转转录录酶酶的的催催化化作作用用下下形形成成cDNA(负负链链DNA)，构构成成RNADNA中中间间体体。中中间间体体中中的的RNA再再经经过过RNA酶酶H水水解解，而而以以剩剩下下的的负负链链DNA复复制制成成双双链链DNA的的过过程程。过过程程是是由由RNA合合成成DNA的的过过程程，需需要要逆逆转转录录酶酶进进行行催催化化。过过程程是是以以单单链链DNA复复制制获获得得双双链链DNA的的过过程程需需要要DNA聚聚合合酶酶催催化化。属属于于双双链链D
18、NA复复制制的的过过程程，需需要要DNA聚聚合合酶酶催催化化。过过程程在在7075 环环境境下下进进行行，所所需需要要的的酶酶应应该该能能够够耐高温。耐高温。本讲稿第二十七页，共四十三页【互互动动探探究究】(1)上上述述过过程程中中需需要要限限制制酶酶和和DNA连连接接酶酶吗吗？(2)由由mRNA逆逆转录转录形成的形成的DNA具有启具有启动动子子吗吗？【提示】【提示】(1)不需要。不需要。(2)无。无。【探探规规寻寻律律】(1)PCR技技术术不不需需要要解解旋旋酶酶，但但需需利利用用9095 高温使高温使DNA分子解旋。分子解旋。(2)PCR技技术术的的前前提提是是要要有有一一段段已已知知目目
19、的的基基因因的的核核苷苷酸酸序列，以便根据序列，以便根据这这一序列合成引物。一序列合成引物。(3)PCR技技术术是是对对已已知知目目的的基基因因的的扩扩增增；从从基基因因库库中中获获取取目目的的基基因因，是是先先找找出出含含有有目目的的基基因因的的细细胞胞，再再通通过过一一定的技定的技术术手段手段获获取目的基因。取目的基因。本讲稿第二十八页，共四十三页基因表达载体的构建和导入受体细胞基因表达载体的构建和导入受体细胞1基因表达基因表达载载体的构建体的构建本讲稿第二十九页，共四十三页特特别别提提醒醒 用用限限制制酶酶切切割割载载体体和和含含目目的的基基因因的的DNA分分子子时时，可可以以使使用用不
20、不同同的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶,但但是是必必须须切出相同黏性末端。切出相同黏性末端。不不同同基基因因可可以以拼拼接接的的原原因因：不不同同生生物物的的基基因因具具有有相相同同的的结结构构和和化化学学组组成成，都都是是双双螺螺旋旋结结构构，都都由由四四种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸组组成成，都都遵遵循循相相同同的的碱碱基基互互补补配配对对原原则则：AT，GC。本讲稿第三十页，共四十三页2目的基因的目的基因的导导入入(1)不同受体不同受体细细胞的常用胞的常用导导入方法入方法生物种生物种类类 植物植物细细胞胞动动物物细细胞胞微生物微生物细细胞胞常用方法常用方法农农杆菌杆菌转转化法化法显
21、显微注射法微注射法Ca2处处理法理法受体受体细细胞胞体体细细胞胞受精卵受精卵原核原核细细胞胞本讲稿第三十一页，共四十三页生物生物种种类类植物植物细细胞胞动动物物细细胞胞微生物微生物细细胞胞转转化化过过程程目的基因插入目的基因插入Ti质质粒的粒的TDNA上上导导入入植物植物细细胞胞整整合到受体合到受体细细胞胞的的DNA表达表达目的基因表达目的基因表达载载体提体提纯纯取取卵卵(受精卵受精卵)显显微注射微注射受精受精卵卵发发育育获获得得具有新性状的具有新性状的动动物物Ca2处处理理细细胞胞感受感受态细态细胞胞表达表达载载体与体与感受感受态细态细胞混胞混合合感受感受态细态细胞吸收胞吸收DNA分分子子本
22、讲稿第三十二页，共四十三页(2)目的基因目的基因导导入受体入受体细细胞胞本讲稿第三十三页，共四十三页不不同同生生物物的的受受体体细细胞胞不不同同：植植物物一一般般为为体体细细胞胞，动动物一般物一般为为受精卵，微生物一般受精卵，微生物一般为为大大肠肠杆菌。杆菌。上上图图中中发发生生与与发发生生相相比比，会会使使目目的的基基因因的的遗遗传传特特性性得得以以稳稳定定维维持持和和表表达达，原原因因是是在在进进行行细细胞胞分分裂裂时时，细细胞胞核核上上的的DNA经经复复制制后后平平均均分分配配到到两两个个子子细细胞胞中中，保保证证了了亲亲子子代代遗遗传传性性状状的的稳稳定定性性，而而细细胞胞分分裂裂时时
23、，细细胞胞质质是不均分的，子是不均分的，子细细胞不一定含有目的基因。胞不一定含有目的基因。本讲稿第三十四页，共四十三页 (2011年高考海南卷年高考海南卷)回答有关基因工程的回答有关基因工程的问题问题：(1)构构建建基基因因工工程程表表达达载载体体时时，用用不不同同类类型型的的限限制制酶酶切切割割DNA后后，可可 能能 产产 生生 黏黏 性性 末末 端端，也也 可可 能能 产产 生生_末末端端。若若要要在在限限制制酶酶切切割割目目的的基基因因和和质质粒粒后后使使其其直直接接进进行行连连接接，则则应应选选择择能能使使二二者者产产生生_(相同、不同相同、不同)黏性末端的限制黏性末端的限制酶酶。例例
24、例例2 2本讲稿第三十五页，共四十三页(2)利利用用大大肠肠杆杆菌菌生生产产人人胰胰岛岛素素时时，构构建建的的表表达达载载体体含含有有人人胰胰岛岛素素基基因因及及其其启启动动子子等等，其其中中启启动动子子的的作作用是用是_。在在表表达达载载体体转转化化大大肠肠杆杆菌菌时时，常常用用_处处理理大大肠肠杆杆菌菌，以以利利于于表表达达载载体体进进入入；为为了了检检测测胰胰岛岛素素基基因因是是否否转转录录出出了了mRNA，可可用用标标记记的的胰胰岛岛素素基基因因片片段段作作探探针针与与mRNA杂杂交交，该该杂杂交交技技术术称称为为_。为为了了检检测测胰胰岛岛素素基基因因转转录录的的mRNA是是否否翻翻
25、译译成成_，常常用用抗抗原原抗体抗体杂杂交技交技术术。本讲稿第三十六页，共四十三页(3)如如果果要要将将某某目目的的基基因因通通过过农农杆杆菌菌转转化化法法导导入入植植物物细细胞胞，先先要要将将目目的的基基因因插插入入农农杆杆菌菌Ti质质粒粒的的_中中,然然后后用用该该农农杆杆菌菌感感染染植植物物细细胞胞,通通过过DNA重重组组将将目目的的基基因因插插入入植植物物细细胞的胞的_上。上。【尝尝试试解解答答】(1)平平相相同同(2)RNA聚聚合合酶酶识识别别和和结结合合的的位位点点，有有了了它它才才能能驱驱动动基基因因转转录录出出mRNA，最最终终获获得得所所需要的蛋白需要的蛋白质质Ca2DNA分
26、子分子杂杂交技交技术术人胰人胰岛岛素素(3)TDNA染色体的染色体的DNA本讲稿第三十七页，共四十三页【解解析析】(1)限限制制酶酶能能识识别别特特定定的的DNA序序列列，并并在在特特定定位位点点上上切切割割DNA，形形成成黏黏性性末末端端或或平平末末端端；要要使使目目的的基基因因和和质质粒粒直直接接进进行行连连接接，应应使使用用同同一一种种限限制制酶酶进进行行切切割割，使使二二者者产产生生相相同同的的黏黏性性末末端端。(2)启启动动子子为为DNA序序列列，其其具具有有RNA聚聚合合酶酶结结合合位位点点，能能启启动动转转录录，合合成成RNA；将将基基因因表表达达载载体体导导入入大大肠肠杆杆菌菌
27、时时，常常用用Ca2 处处理理；检测检测目的基因目的基因时时，常用，常用本讲稿第三十八页，共四十三页分分子子杂杂交交技技术术检检测测目目的的基基因因或或相相应应的的mRNA，或或采采用用抗抗原原抗抗体体杂杂交交技技术术鉴鉴定定相相应应的的蛋蛋白白质质。(3)用用农农杆杆菌菌转转化化法法将将目目的的基基因因导导入入植植物物细细胞胞时时，首首先先将将目目的的基基因因导导入入农农杆杆菌菌Ti质质粒粒的的TDNA中中，再再利利用用农农杆杆菌菌侵侵染染植植物物细细胞胞，通通过过DNA重重组组将将目目的的基基因因插插入入植植物物细细胞胞的的染染色色体体的的DNA上。上。本讲稿第三十九页，共四十三页【误误区
28、区警警示示】(1)切切割割质质粒粒和和目目的的基基因因的的限限制制酶酶必必需需是是同同一一种种酶酶，以以获获得得互互补补的的末末端端，利利于于重重组组质质粒粒的的构构建。建。(2)目的基因的首端和尾端需加上启目的基因的首端和尾端需加上启动动子和子和终终止子。止子。组组成：目的基因启成：目的基因启动动子子终终止子止子标记标记基因基因本讲稿第四十页，共四十三页(3)由由于于受受体体细细胞胞有有植植物物、动动物物、微微生生物物之之分分，以以及及目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞的的方方法法不不同同，因因此此，基基因因表表达达载载体的构建也会有所差体的构建也会有所差别别，不可能是千篇一律的。，不
29、可能是千篇一律的。本讲稿第四十一页，共四十三页跟跟踪踪训训练练(2011年年江江苏苏无无锡锡高高二二检检测测)如如图图为为基基因因表表达达载载体体的的模模式式图图，下下列列有有关关基基因因工工程程中中载载体体的的说说法法错误错误的是的是()本讲稿第四十二页，共四十三页A基因工程的核心步基因工程的核心步骤骤是基因表达是基因表达载载体构建体构建B任任何何基基因因表表达达载载体体的的构构建建都都是是一一样样的的，没没有有差差别别C图图中中启启动动子子位位于于基基因因的的首首端端，是是RNA聚聚合合酶酶识识别别和和结结合的部位合的部位D抗抗生生素素抗抗性性基基因因的的作作用用是是作作为为标标记记基基因因，用用于于鉴鉴别别受受体体细细胞中是否胞中是否导导入了目的基因入了目的基因答案：答案：B本讲稿第四十三页，共四十三页