《第十二章高效液相色谱.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十二章高效液相色谱.ppt（75页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第 十二 章高效液相色谱(HPLC)概述概述n n n高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法 n高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是是2020世纪世纪6060年代末年代末7070年代初年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。n它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因在技术上采用了高压泵、高效固
2、定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱经典液相柱色谱装置色谱装置高效液相色谱仪高效液相色谱仪例：分离例：分离20种氨基酸种氨基酸柱长：柱长：170 cm柱径：柱径：0.9 cmF：30 mL/ht分离分离:20 h经典柱色经典柱色谱谱HPLCt分离分离：1 h经典液相色谱法经典液相色谱法经典液相色谱法经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法（分析型）（
3、分析型）（分析型）（分析型）固定相固定相固定相固定相一般规格一般规格一般规格一般规格特殊规格特殊规格特殊规格特殊规格固定相粒度（固定相粒度（固定相粒度（固定相粒度（mm）7550075500320320固定相粒度分布固定相粒度分布固定相粒度分布固定相粒度分布(RSD)(RSD)2030%2030%5%5%柱长（柱长（柱长（柱长（cmcm）101001010010301030柱内径（柱内径（柱内径（柱内径（cmcm）25250.10.50.10.5柱入口压强（柱入口压强（柱入口压强（柱入口压强（kg/cmkg/cm2 2）0.0110.0112030020300柱效柱效柱效柱效(每米理论塔片数每
4、米理论塔片数每米理论塔片数每米理论塔片数)101001010010104 410105 5样品用量（样品用量（样品用量（样品用量（g g）1101101010-7-71010-2-2分析所需时间（分析所需时间（分析所需时间（分析所需时间（h h）1201200.050.50.050.5装置装置装置装置非仪器化非仪器化非仪器化非仪器化仪器化仪器化仪器化仪器化高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法气相色谱（气相色谱（气相色谱（气相色谱（GCGC）高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱（HPLCHPLC）应用范围应用范围应用范围应用范围 占有机物的占有机物的占有机物的
5、占有机物的20%20%占有机物的占有机物的占有机物的占有机物的80%80%分离效果分离效果分离效果分离效果 高高高高 更高更高更高更高 选选选选 择择择择 性性性性流动相是气体，只流动相是气体，只流动相是气体，只流动相是气体，只能选择固定相能选择固定相能选择固定相能选择固定相 流动相是液体，流流动相是液体，流流动相是液体，流流动相是液体，流动相、固定相都可动相、固定相都可动相、固定相都可动相、固定相都可选择。选择性广。选择。选择性广。选择。选择性广。选择。选择性广。温温温温 度度度度 高温高温高温高温 常温（分离效果好）常温（分离效果好）常温（分离效果好）常温（分离效果好）灵敏度灵敏度灵敏度灵
6、敏度(g/ml)(g/ml)1010-12-12 1010-9-9 液相色谱与气相色谱的比较液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱与气相色谱的比较液相色谱与气相色谱的比较 （l l）气相色谱法分析对象只限于分析气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的气体和沸点较低的化合物化合物，它们仅占有机物总数的，它们仅占有机物总数的2020。对于占有机物总数近。对于占有机物总数近8080的那些的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为：液相色谱能
7、完成难度较高的分离工作，因为：气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中，作用。而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。液相色谱固定相液相色谱固定相类型多类型多，如离子交换色谱和排阻色，如离子交
8、换色谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余地大；而气相色谱可选择余地小的。谱。等，作为分析时选择余地大；而气相色谱可选择余地小的。液相色谱通常在液相色谱通常在室温下操作室温下操作，较低的温度，一般，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。有利于色谱分离条件的选择。（4 4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱
9、技术是互相补充的。的。目目前前高高效效液液相相色色谱谱法法已已被被广广泛泛应应用用于于分分析析对对生生物物学学和和医医药药上上有有重重大大意意义义的的大大分分子子物物质质，例例如如蛋蛋白白质质、核核酸酸、氨氨基基酸酸、多多糖糖类类、植植物物色色素素、高高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法特点高效液相色谱法特点适用范围广；适用范围广；分离性能好；分离性能好；分析速度快；分析速度快；流动相可选择性范围宽；流动相可选择性范围宽；灵敏度较高；灵敏度较高；色谱柱可反复使用；色谱柱可反复使用；流出组分容易收集；流出组分容易收集；安全。安全。高速高速高速高
10、速高效高效高效高效高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度类类 型型主要分离机理主要分离机理主要分析对象或应用领域主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附色谱吸附能，氢键吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备异构体分离、族分离，制备分配色谱分配色谱疏水分配作用疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱凝胶色谱溶质分子大小溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱离子交换色谱库仑力库仑力无机离子、有机离子分析无机离子、有机离子分析离子排斥色谱离子排斥色谱DonnanDonnan膜平衡膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析有机酸、氨
11、基酸、醇、醛分析离子对色谱离子对色谱疏水分配作用疏水分配作用离子性物质分析离子性物质分析疏水作用色谱疏水作用色谱疏水分配作用疏水分配作用蛋白质分离与纯化蛋白质分离与纯化手性色谱手性色谱立体效应立体效应手性异构体分离，药物纯化手性异构体分离，药物纯化亲和色谱亲和色谱生化特异亲和力生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析液相色谱的分类液相色谱的分类液相色谱的分类液相色谱的分类应用应用 由由于于HPLC分分离离分分析析的的高高灵灵敏敏度度、定定量量的的准准确确性性、适适于于非非挥挥发发性性和和热热不不稳稳定定组组分分的的分分析析，因因此此，在在工工业业、科
12、科学学研研究究，尤尤其其是是在在生生物物学学和和医医学学等等方方面面应应用用极极为为广广泛泛。如如氨氨基基酸酸、蛋蛋白白质质、核核酸酸、烃烃、碳碳水水化化合合物物、药药品品、多多糖糖、高高聚聚物物、农农药药、抗抗生生素素、胆胆固固醇醇、金金属属有有机机物物等等分分析析，大大多多是是通通过过HPLC来来完成的。完成的。右右图图是是各各种种HPLC方方法法的的应应用范围及对象用范围及对象极性增加极性增加不溶于水不溶于水溶于水溶于水非极性非极性离子离子非离子极性非离子极性吸附吸附反向分配反向分配分配分配正向分配正向分配离子交换离子交换尺寸排阻尺寸排阻凝胶渗透凝胶渗透凝胶过滤凝胶过滤分分子子量量第一节
13、第一节液相色谱柱效液相色谱柱效一一 液相色谱速率理论液相色谱速率理论可忽略可忽略可忽略可忽略涡涡涡涡流流流流扩扩扩扩散散散散项项项项流流流流动动动动相相相相传传传传质质质质阻阻阻阻力力力力分分分分子子子子扩扩扩扩散散散散项项项项固固固固定定定定相相相相传传传传质质质质阻阻阻阻力力力力项项项项流流流流动动动动相相相相传传传传质质质质阻阻阻阻力力力力流动相流速对板高的影响流动相流速对板高的影响1)小颗粒填料，填充均匀；小颗粒填料，填充均匀；2)选择较低的流动相流速；选择较低的流动相流速；3)选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程：修正的速率方程：提高
14、柱效提高柱效途径途径二二 液相色谱中的柱外谱带展宽液相色谱中的柱外谱带展宽 柱外谱带展宽又称柱外谱带展宽又称柱外谱带展宽又称柱外谱带展宽又称“柱外效应柱外效应柱外效应柱外效应”，系指从进样点，系指从进样点，系指从进样点，系指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的色谱峰展宽，柱效下降色谱峰展宽，柱效下降色谱峰展宽，柱效下降色谱峰展宽，柱效下降。可分为：可分为：可分为：可分为：柱前展宽柱前展宽柱前展宽柱前展宽 主要由进样引起，减小进样器的死体积，
15、用主要由进样引起，减小进样器的死体积，用主要由进样引起，减小进样器的死体积，用主要由进样引起，减小进样器的死体积，用阀门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。阀门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。阀门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。阀门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。可分为：可分为：可分为：可分为：柱后展宽柱后展宽柱后展宽柱后展宽 主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接时间等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接时间等因素所引
16、起。因此，尽可能用短而内径细的接时间等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度等都是克服柱后展宽的途径速度等都是克服柱后展宽的途径速度等都是克服柱后展宽的途径速度等都是克服柱后展宽的途径第二节第二节高效高效液相色谱仪液相色谱仪一、高效液相色谱仪流程图一、高效液相色谱仪流程图1贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质)2高压泵（输液泵）3进样装置4色谱柱分离5检测器分析6废液出口或组分收集器 7记录装置高压泵高压泵流动相
17、流动相溶剂溶剂废液废液色谱柱色谱柱进样口进样口检测器检测器高效液相色谱仪流程图高效液相色谱仪流程图一一 高压输液系统高压输液系统要求要求输出压力高输出压力高平稳、脉冲小平稳、脉冲小流量稳定可调流量稳定可调耐腐蚀耐腐蚀注射泵1 高压泵高压泵 恒流泵恒流泵恒流泵恒流泵特点是在一定操作条特点是在一定操作条特点是在一定操作条特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色件下，输出流量保持恒定而与色件下，输出流量保持恒定而与色件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关，如往复谱柱引起阻力变化无关，如往复谱柱引起阻力变化无关，如往复谱柱引起阻力变化无关，如往复式柱塞泵、注射式螺旋泵；式柱塞泵、注射式
18、螺旋泵；式柱塞泵、注射式螺旋泵；式柱塞泵、注射式螺旋泵；恒压泵恒压泵恒压泵恒压泵是指能保持输出压力恒是指能保持输出压力恒是指能保持输出压力恒是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力定，但其流量则随色谱系统阻力定，但其流量则随色谱系统阻力定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，而变化，故保留时间的重视性差，而变化，故保留时间的重视性差，而变化，故保留时间的重视性差，如气动泵。如气动泵。如气动泵。如气动泵。往复式柱塞泵往复式柱塞泵往复式柱塞泵往复式柱塞泵注射式螺旋泵；注射式螺旋泵；注射式螺旋泵；注射式螺旋泵；2 梯度洗脱装置梯度洗脱装置通过改变流动相的组成来调整组通过改变
19、流动相的组成来调整组分的分的k k值，改变分离因子值，改变分离因子值，值，以达到最短时间内得到最佳分离以达到最短时间内得到最佳分离的目的。的目的。梯度洗脱梯度洗脱适合于二元梯度适合于二元梯度适合于二元梯度适合于二元梯度适合于多元梯度适合于多元梯度适合于多元梯度适合于多元梯度等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱的特点的特点改善分离改善分离,加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形,减少拖尾减少拖尾;可能引起可能引起基线漂移基线漂移分配比变化范围宽的分配比变化范围宽的复杂样品应采取复杂样品应采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱方式分离3 贮液瓶及流动相贮液瓶及流动相1)对样品有一定的溶
20、解度，以防在柱头产生沉淀。对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。对流动相溶剂对流动相溶剂的一般要求的一般要求二二 进样系统进样系统n n取样和进样功能取样和进样功能取样和进样功能取样和进样功能n n手动和自动手动和自动手动和自动手动和自动n n要求：要求：要求：要求：密封性好密封性好密封性好密封性好死体积小死体积小
21、死体积小死体积小重复性好重复性好重复性好重复性好进样时对色谱系统的压力和流量波动小进样时对色谱系统的压力和流量波动小进样时对色谱系统的压力和流量波动小进样时对色谱系统的压力和流量波动小二二 进样系统进样系统 准备状态准备状态 进样状态进样状态六通阀进样六通阀进样 装置装置自动进样器自动进样器 三三 色谱柱色谱柱内径：内径：45 mm，柱长：柱长：1050 cm；柱填料粒径柱填料粒径3 10m 分离柱分离柱干法干法干法干法 填料粒度填料粒度填料粒度填料粒度20202020m m m m时时时时湿法湿法湿法湿法 颗粒颗粒颗粒颗粒20202020m m m m时时时时色谱柱的填充色谱柱的填充色谱柱的
22、填充色谱柱的填充匀浆法装柱示意图匀浆法装柱示意图四四 检测系统检测系统溶质型溶质型检测器检测器总体总体检测器检测器示差折光示差折光检测器检测器介电常数介电常数检测器检测器紫外紫外检测器检测器荧光荧光检测器检测器电化学电化学检测器检测器1 紫外吸收检测器紫外吸收检测器(a)可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器二极管阵列检测器氘灯氘灯光栅光栅流流通通池池测测量量光光电电二二极极管管参比光电二极管参比光电二极管2 二极管阵列检测器二极管阵列检测器两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器二极管阵列检测器(b)(a
23、)紫外检测器紫外检测器灵敏度高，灵敏度高，精密度及线性范围较好精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。，可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂CS2氯仿氯仿 四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截紫外截止波长止波长/nm380245212210 1902051873 荧光检测器荧光检测器灵敏度高，选择灵敏度高，选择性好，可用于梯度性好，可用于梯度洗脱。洗脱。4 示差折光检测器示差折光检测器利用组分与流动利用组分与流动相的折射率之差进相的折射率之差进行检测。行检测。通用性好，灵敏通用性好，灵敏度较低，不适用于度较低
24、，不适用于梯度洗脱。梯度洗脱。5 化学发光检测器化学发光检测器6 电化学检测器电化学检测器电导检测器电导检测器安培检测器安培检测器7 质谱检测器质谱检测器五五 检测系统检测系统脱气装置脱气装置 梯度洗脱梯度洗脱 再循环再循环 恒温恒温 馏分收集馏分收集及处理及处理第三节第三节分配色谱分配色谱分离原理分离原理K不仅与固定相的不仅与固定相的种类有关，也与流种类有关，也与流动相的种类有关动相的种类有关液液分配色谱液液分配色谱液液色谱液液色谱键和相色谱键和相色谱通过物理吸附的方法将液相固定液涂在载体的表面通过物理吸附的方法将液相固定液涂在载体的表面通过物理吸附的方法将液相固定液涂在载体的表面通过物理吸
25、附的方法将液相固定液涂在载体的表面通过化学键合方法将液相固定液涂在载体的表面通过化学键合方法将液相固定液涂在载体的表面通过化学键合方法将液相固定液涂在载体的表面通过化学键合方法将液相固定液涂在载体的表面固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。此它适用于种类繁多样品的分离。缺点缺点特点特点固定液溶液流失固定液溶液流失固定液溶液流失固定液溶液流失一、化学键合固定相一、化学键合固定相一、化学键合固定相一、化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相
26、化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；硅硅硅硅胶胶胶胶为为为为基基基基体体体体，利利利利用用用用硅硅硅硅胶胶胶胶表表表表面面面面的的的的硅硅硅硅醇醇醇醇基基基基(SiSiSiSi一一一一OH)OH)OH)OH)与与与与有有有有机机机机分分分分子子子子之之之之间间间间成成成成键键键键,即即即即可可可可得得得得到到到到各各各各种种种种性性性性能能能能的的的的固固固固定定定定相相相相。一一一一般可分三类般可分三类般可分三类般可分三类（1 1 1 1）疏疏疏疏水水水水基基基基团团团团 如如如如不不
27、不不同同同同链链链链长长长长的的的的烷烷烷烷烃烃烃烃（C C C C8 8 8 8和和和和C C C C18181818）和和和和苯苯苯苯基基基基等；等；等；等；（2 2 2 2）极性基团极性基团极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；（3 3 3 3）离离离离子子子子交交交交换换换换基基基基团团团团 如如如如阴阴阴阴离离离离子子子子交交交交换换换换基基基基团团团团：胺胺胺胺基基基基，季季季季铵铵铵铵盐；阳离子交换基团：磺酸等。盐；阳离子交换基团：磺酸等。盐；阳离子交换基团：磺酸等。盐；阳离子交换基团：磺
28、酸等。键和类型键和类型键和类型键和类型键合方法键合方法键合方法键合方法（l l l l）硅硅硅硅酸酸酸酸酯酯酯酯型型型型（SiSiSiSi一一一一OROROROR）键键键键合合合合相相相相，适适适适用用用用于于于于不不不不含含含含水或醇的流动相；水或醇的流动相；水或醇的流动相；水或醇的流动相；（2 2 2 2）硅硅硅硅氮氮氮氮型型型型（SiSiSiSi一一一一N N N N=）键键键键合合合合相相相相，可可可可用用用用于于于于非非非非极极极极性性性性或或或或强强强强极极极极性性性性的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂作作作作流流流流动动动动相相相相，当当当当使使使使用用用用水水水水溶溶溶溶液液液液时时时时
29、，必须限制必须限制必须限制必须限制pHpHpHpH在在在在4 4 4 4 8 8 8 8范围内；范围内；范围内；范围内；（3 3 3 3）硅碳型（）硅碳型（）硅碳型（）硅碳型（SiSiSiSi一一一一C C C C）键合相，同硅氮型；键合相，同硅氮型；键合相，同硅氮型；键合相，同硅氮型；（4 4 4 4）硅硅硅硅氧氧氧氧烷烷烷烷型型型型（SiSiSiSi一一一一O O O O一一一一SiSiSiSi一一一一C C C C）键键键键合合合合相相相相，具具具具有有有有热热热热稳稳稳稳定定定定性性性性好好好好，不不不不易易易易吸吸吸吸水水水水，耐耐耐耐有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂，能能能能在在在
30、在70707070 C C C C以下，以下，以下，以下，pHpHpHpH在在在在2 2 2 2 8 8 8 8范围内正常工作。范围内正常工作。范围内正常工作。范围内正常工作。2.键合相色谱法分类键合相色谱法分类反相键合相色谱反相键合相色谱:常用固定相：常用固定相：C18分离对象分离对象非极性非极性中等极性化合物中等极性化合物常用流动相常用流动相甲醇甲醇-水水乙腈乙腈-水水反相键合相色谱反相键合相色谱疏溶剂分离机制疏溶剂分离机制固定相极性固定相极性 流动相极性流动相极性离子性键合相色谱离子性键合相色谱 将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子
31、性键合相色谱的固定相。表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。其分离原理与离子交换色谱类同。3.化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1 1 1 1）传质快传质快传质快传质快（2 2 2 2）寿命长寿命长寿命长寿命长（4 4 4 4）选择性好选择性好选择性好选择性好（5 5 5 5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；存在着存在着存在着存在着双重分离机制双重分离机制双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；高覆盖
32、率：分配为主；高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；二、固定相流动相的选择二、固定相流动相的选择二、固定相流动相的选择二、固定相流动相的选择第二，流动相的极性与分析物质的极性相匹配，用第二，流动相的极性与分析物质的极性相匹配，用第二，流动相的极性与分析物质的极性相匹配，用第二，流动相的极性与分析物质的极性相匹配，用极性明显不同固定相。极性明显不同固定相。极性明显不同固定相。极性明显不同固定相。第三，固定相的极性与分析物质的极性相匹配，第三，固定相的极性与分析物质的极性相匹配，第三，固定相的极性与分析物质的极性相匹
33、配，第三，固定相的极性与分析物质的极性相匹配，仅有流动相的差异使分析物质沿柱移动。仅有流动相的差异使分析物质沿柱移动。仅有流动相的差异使分析物质沿柱移动。仅有流动相的差异使分析物质沿柱移动。柱子的选择柱子的选择柱子的选择柱子的选择第一，固定相的极性与分析物质的极性粗配，用第一，固定相的极性与分析物质的极性粗配，用第一，固定相的极性与分析物质的极性粗配，用第一，固定相的极性与分析物质的极性粗配，用极性明显不同的流动相洗脱。极性明显不同的流动相洗脱。极性明显不同的流动相洗脱。极性明显不同的流动相洗脱。反相键合相色谱反相键合相色谱:常用流动相常用流动相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水分离对象分离对象非极
34、性非极性中等极性化合物中等极性化合物通过调节水的含量，通过调节水的含量，通过调节水的含量，通过调节水的含量，可使保留因子可使保留因子可使保留因子可使保留因子k k迅速变化迅速变化迅速变化迅速变化通过改变流动相的化学性质，通过改变流动相的化学性质，通过改变流动相的化学性质，通过改变流动相的化学性质，可使选择因子可使选择因子可使选择因子可使选择因子 迅速变化迅速变化迅速变化迅速变化反相色谱四溶剂系统反相色谱四溶剂系统反相色谱四溶剂系统反相色谱四溶剂系统甲醇、乙腈、四氢呋喃、水甲醇、乙腈、四氢呋喃、水甲醇、乙腈、四氢呋喃、水甲醇、乙腈、四氢呋喃、水正相色谱四溶剂系统正相色谱四溶剂系统正相色谱四溶剂系
35、统正相色谱四溶剂系统乙醚、氯仿、三氯甲烷、正己烷乙醚、氯仿、三氯甲烷、正己烷乙醚、氯仿、三氯甲烷、正己烷乙醚、氯仿、三氯甲烷、正己烷调节调节调节调节k k k k调节调节调节调节三、洗脱物的流出顺序三、洗脱物的流出顺序反相键合相色谱反相键合相色谱:极性大的先流出，极性小的后流出极性大的先流出，极性小的后流出正相键合相色谱正相键合相色谱:极性小的先流出，极性大的后流出极性小的先流出，极性大的后流出四、分配色谱的应用四、分配色谱的应用通过改变流动相的组成，容易调节通过改变流动相的组成，容易调节通过改变流动相的组成，容易调节通过改变流动相的组成，容易调节kk反相键和相色谱的优点反相键和相色谱的优点反
36、相键和相色谱的优点反相键和相色谱的优点用单柱和流动相就能分离非离子化合物、用单柱和流动相就能分离非离子化合物、用单柱和流动相就能分离非离子化合物、用单柱和流动相就能分离非离子化合物、离子化合物、可电离化合物离子化合物、可电离化合物离子化合物、可电离化合物离子化合物、可电离化合物用便宜的水作为流动相的主体，以价格适宜用便宜的水作为流动相的主体，以价格适宜用便宜的水作为流动相的主体，以价格适宜用便宜的水作为流动相的主体，以价格适宜且易纯化的甲醇为有机改性剂且易纯化的甲醇为有机改性剂且易纯化的甲醇为有机改性剂且易纯化的甲醇为有机改性剂可以预言洗脱顺序可以预言洗脱顺序可以预言洗脱顺序可以预言洗脱顺序色
37、谱柱平衡快，适宜梯度洗脱色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱 反相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非反相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非反相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非反相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物，因为键合相表面极性至中等极性的各类分子型化合物，因为键合相表面极性至中等极性的各类分子型化合物，因为键合相表面极性至中等极性的各类分子型化合物，因为键合相表面的官能团不流失，溶剂的极性可以在很大范围内调整，的官能团不流失，溶剂的极性可以在很大范围内调整，的官能团不流失，溶剂的极性可以在
38、很大范围内调整，的官能团不流失，溶剂的极性可以在很大范围内调整，因此应用范围很宽。由它派生的反相离子对色谱法与离因此应用范围很宽。由它派生的反相离子对色谱法与离因此应用范围很宽。由它派生的反相离子对色谱法与离因此应用范围很宽。由它派生的反相离子对色谱法与离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。物。物。物。用反相液相色谱法，可以解决用反相液相色谱法，可以解决用反相液相色谱法，可以解决用反相液相色谱法，可以解决80%80%80%80%左右的液
39、相色谱左右的液相色谱左右的液相色谱左右的液相色谱课题。课题。课题。课题。因此，必须给予反相色谱法足够的重视。对于结因此，必须给予反相色谱法足够的重视。对于结因此，必须给予反相色谱法足够的重视。对于结因此，必须给予反相色谱法足够的重视。对于结构异构体等难分离物质的分离，则应选用吸附色谱法。构异构体等难分离物质的分离，则应选用吸附色谱法。构异构体等难分离物质的分离，则应选用吸附色谱法。构异构体等难分离物质的分离，则应选用吸附色谱法。具体看表具体看表具体看表具体看表21-321-321-321-3第四节第四节液固吸附色谱液固吸附色谱一一 吸附色谱法吸附色谱法1 分离原理分离原理Kad值越大，保留时间
40、越长。值越大，保留时间越长。2 固定相固定相硅胶强极性硅胶强极性氧化铝弱极性氧化铝弱极性活性炭非极性活性炭非极性分子筛分子筛强极性强极性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂固体吸附剂3 流动相流动相(洗脱剂洗脱剂)越大，越大，表明流动相溶剂分子对吸表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。剂上将被吸附的溶质洗脱下来。溶剂分子在单位吸附剂表面上的溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能吸附自由能溶剂强度参数溶剂强度参数硅胶固定相分离苯，甲苯，硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯乙苯，丙苯，丁苯流动相：流动相：干
41、燥正庚烷干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷份干燥正庚烷水饱和的正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的改变流动相的组成可改变分离组成可改变分离的选择性的选择性4 应用应用具有具有不同官能团的化合物不同官能团的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物异构体异构体例：几种取代位置不同的硝基例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：的滞留顺序：邻位邻位 间位间位 对位对位邻邻硝硝基基苯苯胺胺间间硝硝基基苯苯胺胺对对硝硝基基苯苯胺胺适合分离的物适合分离的物质质第五节第五节其他色谱分析其他色谱分析一一 离子
42、交换色谱法离子交换色谱法阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换1 分离原理分离原理2 固定相固定相阳离子阳离子：SO3H(强强)CO2H(弱弱)阴离子：阴离子：N+R3(强强)NH2(弱弱)基基质质合成树脂合成树脂纤维素纤维素硅胶硅胶离子交换剂离子交换剂3 流动相流动相水相水相缓冲液缓冲液+有机改性剂有机改性剂调节选择性的调节选择性的主要参数主要参数盐种类及浓度盐种类及浓度pH值值各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快4 应用应用离子及可离解的化合物离子及可离
43、解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白质等如氨基酸、核酸、蛋白质等二二 尺寸排阻尺寸排阻(凝胶凝胶)色谱法色谱法排阻色谱分离示意图排阻色谱分离示意图相对分子质量差别相对分子质量差别大于大于10的化合物的化合物才可以分离才可以分离1 分离原理分离原理2 固定相固定相是一种经过是一种经过交联而具有立体交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水）有大量液体（一般是水）凝胶凝胶3 流动相流动相不采用改变流动相组成的不采用改变流动相组成的方法控制分离度方法控制分离度三、分离类型选择三、分离类型选择四、四、HPLC的的应用应用 1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器