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1、DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析薄层层析薄层层析（Thin-layer chromatography,TLC)o薄层层析薄层层析 -是吸附剂在平滑的玻璃板或聚脂薄膜是吸附剂在平滑的玻璃板或聚脂薄膜上铺成薄层作为固定相，以溶剂作为流动上铺成薄层作为固定相，以溶剂作为流动相，将样品中各组分分离的方法。相，将样品中各组分分离的方法。分离原理：分离原理：吸附层析吸附层析吸附层析的概念及原理吸附层析的概念及原理o吸附吸附 -一种物质被聚集在另一种物质表面的一种物质被聚集在另一种物质表面的现象。现象。吸附剂：吸附剂：-凡是能够将其他物质聚集到本身分子表凡是能够将其他物质聚集到本
2、身分子表面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。被吸附物被吸附物 -聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附物。物。吸附层析吸附层析（Absorption Chromatography)o各组分与流动相分子争夺吸附剂表面各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离附能力差异而实现分离.主要是利用吸附剂对不同物质吸附力主要是利用吸附剂对不同物质吸附力的不同而达到分离的目的。的不同而达到分离的目的。薄层层析中薄层层析中吸附剂选择吸附剂选择是关键。是关键。吸附剂吸
3、附剂吸附剂的选择吸附剂的选择（1）应不溶于所使用的溶剂）应不溶于所使用的溶剂;与所使用的溶与所使用的溶剂和样品中各组分不起化学反应；剂和样品中各组分不起化学反应；（2）应具有较大的吸附表面（吸附容量）应具有较大的吸附表面（吸附容量）和一定的吸附力和一定的吸附力;对被分离个组分有不同对被分离个组分有不同的吸附力的吸附力,有足够的分辨力；有足够的分辨力；（3）吸附剂颗粒大小要均匀，保持良好的）吸附剂颗粒大小要均匀，保持良好的重复性。重复性。吸附剂的吸附能力吸附剂的吸附能力o常称为活度，用罗马字母常称为活度，用罗马字母、表示。表示。活度活度 强强 弱弱 含水量含水量 多多 少少常用吸附剂常用吸附剂p
4、极性：极性：硅胶硅胶:为首选吸附剂。本身具微酸性，适用于分离酸为首选吸附剂。本身具微酸性，适用于分离酸性及中性物质。性及中性物质。氧化铝氧化铝:氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点碱性碱性/中性中性/酸性酸性氧化铝氧化铝p非极性：非极性：纤维素纤维素聚酰胺：聚酰胺：合成：己二酸、己二胺合成：己二酸、己二胺特点：氢键吸附剂特点：氢键吸附剂是是类类化学化学纤维纤维原料，即原料，即锦纶锦纶(又称尼又称尼龙龙)。由己二酸与己二胺聚合而成。由己二酸与己二胺聚合而成。因因为为在在这类这类物物质质分子中都含有大量分子中都含有大量酰酰胺基胺基团团，故故统统称聚称聚酰
5、酰胺。胺。聚酰胺聚酰胺是由于聚酰胺的是由于聚酰胺的-CO(羰基羰基)及及NH(氨基氨基)能与被分离物能与被分离物质之间形成氢键。质之间形成氢键。如酚类如酚类(包括黄酮类、鞣质等包括黄酮类、鞣质等)和酸类（如核苷酸、氨和酸类（如核苷酸、氨基酸等基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键如硝基化合物和醌类等物质如硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键与酰胺键的氨基形成氢键被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表
6、面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离吸的展层过程，可以一一分离.聚酰胺对极性物质的吸附作用聚酰胺对极性物质的吸附作用溶剂溶剂p不同溶剂具有不同的结构性质，依极性不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大小各种溶剂的洗脱能力各不相同。大小各种溶剂的洗脱能力各不相同。一般所选溶剂要求：一般所选溶剂要求：a.纯度合格纯度合格b.黏度要小黏度要小易与样品中各组分相分离易与样品中各组分相分离c.与所欲分离样品
7、和吸附剂不起化学反应与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应溶剂选择考虑因素溶剂选择考虑因素1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力、溶剂与吸附剂之间的相互作用力2、溶剂与样品之间的作用因素、溶剂与样品之间的作用因素溶剂的选择可通过实验来确定。溶剂的选择可通过实验来确定。薄层层析的操作薄层层析的操作1、点样、点样样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在溶丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在溶剂挥发后反复进行至点完为止。剂挥发后反复进行至点完为止。样品原点直径样品原点直径3mm2.平衡平衡3.展开展开方法：方法：上行层析法上行层析法下行层
8、析法下行层析法双向展开法双向展开法显色显色1）有色物质（如黄体酮）展开后即可显）有色物质（如黄体酮）展开后即可显出斑点出斑点2）紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和）紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和某些生物碱某些生物碱3）显色剂显色）显色剂显色p荧光试剂荧光试剂 DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯p蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基结合结合pDNS-aa发出黄绿色荧光发出黄绿色荧光DNS-Cl在在pH过过高高时时，水解，水解产产生副生副产产物物DNS-OH，即：，即：在在DNS-Cl过过量量时时，会，会产产生生DNS-NH2，即：，即：DNS-氨基酸在紫
9、外光照射下呈现氨基酸在紫外光照射下呈现黄色黄色荧光荧光DNS-OH和和DNS-NH2产生产生蓝色蓝色荧光荧光可彼此区分。可彼此区分。三、薄层层析的应用三、薄层层析的应用（一）定性分析：将已知化合物作为标准品与（一）定性分析：将已知化合物作为标准品与样品一起进行层析后对照，可初步确定未知样品一起进行层析后对照，可初步确定未知化合物的组成。化合物的组成。（二）定量分析：可直接在薄板上测定，无须（二）定量分析：可直接在薄板上测定，无须破坏薄层；破坏薄层；用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱，用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱，再用其他方法测定。再用其他方法测定。临床生化上的应用临床生化上的应用1.
10、氨基酸的分离氨基酸的分离2.核苷、核苷酸和核酸的分析核苷、核苷酸和核酸的分析DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 p二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯(1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride，DNS-Cl)可与氨基酸的游离氨基结合成可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基氨基酸。酸。p形成的形成的DNS-氨基酸在紫外线（氨基酸在紫外线（260nm或或365nm）照射下发出强烈的黄色荧光，因此可）照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测用荧光检测DNS-氨基酸的存在。氨基酸的存在。pH9.840,30min本实验中，聚酰胺
11、上胺基与氨基酸本实验中，聚酰胺上胺基与氨基酸的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基与与AAAA中羟基或酚基形成氢键。由于中羟基或酚基形成氢键。由于有些有些AAAA结构相似，如只采用一种溶结构相似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难达到完全剂系统进行单向层析，难达到完全分离的目的。因此可选择另一溶剂分离的目的。因此可选择另一溶剂系统进行第二向层析。系统进行第二向层析。第一向第一向苯冰醋酸苯冰醋酸 第二向第二向甲酸水甲酸水二甲氨基萘磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游）可与氨基酸的游离氨基结合成离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的氨基酸。形成的DNS-氨基氨
12、基酸在紫外光下呈黄绿色荧光。酸在紫外光下呈黄绿色荧光。DNS-Cl+AA DNS-AA+HCl 反应的副产物：反应的副产物：DNS-NH2黄色荧光和黄色荧光和DNS-OH蓝色荧光蓝色荧光显色显色DNS-氨基酸的双向层析图谱氨基酸的双向层析图谱颉颉亮亮苯苯丙丙赖赖甘甘丝丝天天脯脯谷谷1、DNS氨基酸的制备氨基酸的制备2、混合、混合DNS氨基酸的双向层析氨基酸的双向层析（1）点样。距）点样。距右右下角距两边各下角距两边各0.5cm，直径控制在，直径控制在23mm之间，点在无光泽面之间，点在无光泽面,可重复几次点样。可重复几次点样。（2）苯冰醋酸层析：展层剂前缘距薄膜顶端）苯冰醋酸层析：展层剂前缘距
13、薄膜顶端3mm处处即可停止即可停止,冷冷风吹干，紫外观察。风吹干，紫外观察。（3）甲酸水层析：调转）甲酸水层析：调转90度与第一相垂直，度与第一相垂直，热热风吹风吹干，紫外灯下观察，用铅笔干，紫外灯下观察，用铅笔轻轻轻轻标记。标记。操作以及注意事项操作以及注意事项（1 1）严格控制点样位置以及点样直径。）严格控制点样位置以及点样直径。（2 2）展层时勿将点样浸入溶剂系统。）展层时勿将点样浸入溶剂系统。（3 3）展层后必须经电吹风将膜吹干。）展层后必须经电吹风将膜吹干。（4 4）使用紫外照射时要注意使用时间短）使用紫外照射时要注意使用时间短.注意注意Procedure for TLC1.Prep
14、are the developing container.ThedevelopingcontainerforTLCcanbeaspeciallydesignedchamber,ajarwithalid,orabeakerwithawatchglassonthetop:Pour solvent into the beaker to a depth of just less than 0.5 cm.To aid in the saturation of the TLC chamber with solvent vapors,line part of the inside of the beaker
15、 with filter paper Cover the beaker with a watch glass,swirl it gently,and allow it to stand while you prepare your TLC plate.TLC plates used in the organic chem teaching labs are purchased as 5 cm x 20 cm sheets.Each large sheet is cut horizontally into plates which are 5 cm tall by various widths;
16、the more samples you plan to run on a plate,the wider it needs to be.Prepare the TLC plate.Shown in the photo to the left is a box of TLC plates,a large un-cut TLC sheet,and a small TLC plate which has been cut to a convenient size.Plates will usually be cut and ready for you when you come to lab.Ha
17、ndle the plates carefully so that you do not disturb the coating of adsorbent or get them dirty.Measure 0.5 cm from the bottom of the plate.Take care not to press so hard with the pencil that you disturb the adsorbent.Using a pencil,draw a line across the plate at the 0.5 cm mark.This is the origin:
18、the line on which you will spot the plate.Its kind of hard to see the pencil line in the above photos,so here is a close-up of how the plate looks after the line has been drawn.Under the line,mark lightly the name of the samples you will spot on the plate,or mark numbers for time points.Leave enough
19、 space between the samples so that they do not run together,about 4 samples on a 5 cm wide plate is advised.Use a pencil and do not press down so hard that you disturb the surface of the plate.A close-up of a plate labeled 1 2 3 is shown to the right.Spot the TLC plate.swirl until dissolvedadd a few
20、 drops of solvent.dip the microcap into solution-the arrow points to the microcap,it is tiny and hard to see make sure it is filled-hold it up to the light if necessary touch the filled microcap to TLC plate to spot it-make sure you watch to see that all the liquid has drained from the microcap rins
21、e the microcap with clean solvent by first filling it.and then draining it by touching it to a paper towel heres the TLC plate,spotted and ready to be developedDevelop the plate.place the TLC plate in the developing container-make sure the solvent is not too deepThe solvent will rise up the TLC plat
22、e by capillary action.In this photo,it is not quite halfway up the plate.In this photo,it is about 3/4 of the way up the plate.Remove the plate from the beaker.quickly mark a line across the plate at the solvent front with a pencilAllow the solvent to evaporate completely from the plate.If the spots
23、 are colored,simply mark them with a pencil.Visualize the spots Most samples are not colored and need to be visualized with a UV lamp.Hold a UV lamp over the plate and mark any spots which you see lightly with a pencil.this is a UV lamphere are two proper sized spots,viewed under a UV lamp(you would
24、 circle these while viewing them)The plate shows three compounds run at three different concentrations.The middle and right plate show reasonable spots;the left plate is run too concentrated and the spots are running together,making it difficult to get a good and accurate Rf reading.Heres what overl
25、oaded plates look like compared to well-spotted plates.The plate on the left has a large yellow smear;this smear contains the same two compounds which are nicely resolved on the plate next to it.The plate to the far right is a UV visualization of the same overloaded plate.The retention factor,or Rf,is defined as the distance traveled by the compound divided by the distance traveled by the solvent.