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1、实验七：实验七：DNS-氨基酸氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白与鱼精蛋白背背 景景层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为被分开，由此得名为“色谱法色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分
2、离。英国生物学家英国生物学家Martin和和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。他们首先提出了色谱塔板理论。1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析等。气相层析、高压液相层析等。叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图层析的两种相层析的两种相固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤
3、维素上的溶液），这些基质能与待分离的等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。超临界体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子层析法是利用混合物中各组分物理化
4、学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。按层析过程的机理分类：按层析过程的机理分类：分配层析分配层析:根据不同组分在不同溶剂中分配系数不同而使物质分离的方法称为分配根据不同组分在不
5、同溶剂中分配系数不同而使物质分离的方法称为分配层析。层析。吸附层析吸附层析:吸附是两相成一界面，溶质在表面密集的现象。以吸附剂为固定相，根吸附是两相成一界面，溶质在表面密集的现象。以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术称为吸附层析。据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术称为吸附层析。常用吸附剂：活性碳、硅。常用吸附剂：活性碳、硅。离子交换层析离子交换层析:是以离子交换剂为固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差异是以离子交换剂为固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差异而将物质予以分离的一种方法。而将物质予以分离的一种方法。凝胶层
6、析（分子筛）利用凝胶颗粒形成具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带凝胶层析（分子筛）利用凝胶颗粒形成具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或电荷，可起滤过或“筛筛”的作用。的作用。亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。层析法分类层析法分类层析法分类层析法分类按两相所处的状态分类：按两相所处的状态分类：流动相有两种状态：液体作为流动相流动相有两种状态：液体作为流动相 气体作为流动相气体作为流动相固定相也有两种状态：固体吸附剂作为固定相固定相也有两种状态：固体吸附剂作为固定相 以吸附在固体上的液体作为固定相以吸
7、附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为：按两相所处的状态分为：液相层析和气相层析液相层析和气相层析 流动相流动相固定相固定相 液体液体 （液相层析（液相层析)气体气体 （固相层析）（固相层析）液液 体体 液液-液层析液层析气气-液层析液层析 固固 体体 液液-固层析固层析气气-固层析固层析层析法分类层析法分类名称名称操作形式操作形式适用范围适用范围柱层析柱层析将固定相装于柱内，使将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而样品沿一个方向移动而达到分离的目的。达到分离的目的。柱层析是常用的层析形式，适用于大量样柱层析是常用的层析形式，适用于大量样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层品分析、分
8、离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。色谱等都通常采用柱层析形式。薄层层析薄层层析将将适当粘度的固定相均适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各后用流动相展开，使各组份分离组份分离薄层层析主要适用于小分子物质的快速检薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使测分析和少量分离制备，通常为一次性使用。用。按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：吸附层析吸附层析原理：任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在原理：任何两个相都
9、可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此表面密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得此表面密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得到分的现象就叫吸附层析。到分的现象就叫吸附层析。凡能将其他物质聚集到自己表面的物质称吸附剂，包括硅皮、氧化铝、活性炭、凡能将其他物质聚集到自己表面的物质称吸附剂，包括硅皮、氧化铝、活性炭、淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂表面的物质称被吸附剂。淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂表面的物质称被吸附剂。吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外，还有化学作用，如吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外，还
10、有化学作用，如DNS-DNS-氨基酸氨基酸双向聚酰胺薄膜层析时中被分离的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于双向聚酰胺薄膜层析时中被分离的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之间形成氢键。二者之间形成氢键。分配层析技术分配层析技术 （液（液-液层析法）液层析法）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。同而达到分离各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。特点：液特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体液层析法适合于分离同
11、系物或同分异构体分配层析技术分配层析技术分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相中分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。分配系数主要与下列因素有关：分配系数主要与下列因素有关：被分离物质本身的性质；被分离物质本身的性质；固定相和流动相的性质；固定相和流动相的性质；层析柱的温度。层析柱的温度。相关的概念（一）：相关的概念（一）：分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它
12、在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数浓度之比是个常数，称为分配系数(Kd)。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据 Kd=Cs/Cm 其中其中Cs:固定相中的浓度，固定相中的浓度，Cm:流动相中的浓度流动相中的浓度分配层析技术分配层析技术相关的概念（二）：相关的概念（二）：迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用身移动的距离之比值。常用RfRf来表示来表示。物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，物质在一定溶剂中的
13、分配系数是一定的，Rf值也是恒定的，因此可以根据值也是恒定的，因此可以根据RfRf值来值来鉴定被分离的物质。鉴定被分离的物质。Rf=色斑中心至原点中心的距离色斑中心至原点中心的距离溶剂前缘至原点中心的距离溶剂前缘至原点中心的距离原理原理聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离物质与薄膜形成氢键，而各物质形成氢键的能力不同，决定吸附力的差于被分离物质与薄膜形成氢键，而各物质形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。展层速度慢，吸附力弱，展
14、层速度快。展层溶剂与被分离物质与聚酰胺薄膜表面的离子竞争形成氢键，选择适当的展层展层溶剂与被分离物质与聚酰胺薄膜表面的离子竞争形成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有最大差异。易溶溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有最大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。DNS-氨基酸氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析的双向聚酰胺薄膜层析本实验中，聚酰胺上的氨基与氨基酸（本实验中，聚酰胺上的氨基与氨基酸（AA）的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基与的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基与AA
15、中羟中羟基或酚基形成氢键。由于有些基或酚基形成氢键。由于有些AA结构相似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难达到结构相似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难达到完全分离的目的。因此可选择另一溶剂系统进行第二向层析。这种层析方法称为双向层析。完全分离的目的。因此可选择另一溶剂系统进行第二向层析。这种层析方法称为双向层析。第一向：苯冰醋酸溶剂第一向：苯冰醋酸溶剂 第二向：甲酸水第二向：甲酸水显色：二甲氨基萘磺酰氯（显色：二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游离氨基结合成可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黄色荧光。氨基酸在紫外光下呈黄
16、色荧光。DNS-Cl+AADNS-AA+HCl实验操作实验操作1.DNS-氨基酸的制备（已完成）氨基酸的制备（已完成）2.混合混合DNS氨基酸的双向层析氨基酸的双向层析点样：在薄膜右下角距两边各点样：在薄膜右下角距两边各0.6cm，直径控制在直径控制在23mm之间，点在无光泽面之间，点在无光泽面，可，可重复点样重复点样2-3次；次；苯冰醋酸层析：将点好样品的薄膜用回形针固定放入展层剂中，展层剂前缘在距苯冰醋酸层析：将点好样品的薄膜用回形针固定放入展层剂中，展层剂前缘在距薄膜顶端薄膜顶端2mm处即可停止处即可停止,冷风吹干冷风吹干，紫外灯下观察；，紫外灯下观察；甲酸水层析：调转甲酸水层析：调转9
17、0度与第一相垂直，放入展层剂中，度与第一相垂直，放入展层剂中，热风吹干热风吹干，紫外灯下观察，紫外灯下观察，用铅笔轻轻标记用铅笔轻轻标记（以免损坏薄膜表面）（以免损坏薄膜表面）；分析实验结果；分析实验结果；将层析后标记好的薄膜将层析后标记好的薄膜以点样点为左下角贴于实验报告中以点样点为左下角贴于实验报告中。3 3、操作注意事项：、操作注意事项：严格控制点样位置以及点样直径。严格控制点样位置以及点样直径。展层时勿将点样点浸入展层剂中。展层时勿将点样点浸入展层剂中。展层后必须经电吹风将膜吹干。展层后必须经电吹风将膜吹干。紫外光对眼睛有害不要把头伸到灯下观察。紫外光对眼睛有害不要把头伸到灯下观察。颉
18、颉亮亮苯苯丙丙赖赖甘甘丝丝天天脯脯谷谷DNS-氨基酸的双向层析预期实验结果氨基酸的双向层析预期实验结果凝胶层析技术凝胶层析技术概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移
19、动，并最先被胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。凝胶层析的原理凝胶层析的原理1.1.分子大小不同混合物上柱；分子大小不同混合物上柱；2.2.洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3.3.大小分子分开：大小分子分开：4.4.大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。大
20、分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。凝胶颗粒凝胶颗粒是一类具有三维空间多孔性网络结构的物质，是一类具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或不带电荷，可起滤过或“筛筛”的作用。的作用。凝胶层析的基本概念凝胶层析的基本概念外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨
21、架体积。柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为外水体积为Vo，内水体积为内水体积为Vi，基质体积为基质体积为Vg，则有：则有：VtVoViVg 由于由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：相对很小，可以忽略不计，则有：VtVoVi 凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）外水体积（外水体积（V0）内水体积（内水体积（Vi）基质体积（基质体积（Vg）基质体积（基质体积（Vt）
22、当分子的当分子的Kd0时，时，VeVo即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动相里，固定相里分布为零（相里，固定相里分布为零（A)；当分子的当分子的Kd1时，时，VeVo+Vi即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定相里，两相比值为相里，两相比值为1(C)；当当0 Kd 1时时，Ve=Vo+Kd*Vi即表明分子受到部分排阻即表明分子受到部分排阻(B)。样样品品的的量量洗脱体积洗脱体积实验原理实验原理由于由于Hb（红色，分子量（红色，分子量64500）与二硝苯与二硝苯-鱼精蛋白鱼精蛋白（黄
23、色，分子量（黄色，分子量2000-12000）的）的分子量不同分子量不同，通过交联葡聚糖凝胶通过交联葡聚糖凝胶G-50（sephadex）层析柱用蒸馏水洗脱分离。从层析柱用蒸馏水洗脱分离。从颜色不同可直接观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。颜色不同可直接观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。凝胶层析分离血红蛋白凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白与鱼精蛋白G类葡聚糖凝胶（类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是糖为残基的多糖，分子间主要是-1,6-糖苷键（约占糖苷键（约占95%），分枝
24、为），分枝为l,3-糖苷键糖苷键（约占（约占5%），以），以1-氯氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物。结构的高分子化合物。葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。G类葡聚糖凝胶常用类葡聚糖凝胶常用G-X代表，代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。数字既代表交联度，也
25、代表特水量。X数字越小，交联数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示表示1g干胶持干胶持水水2.5ml，G-100表示表示 1g干胶持水干胶持水10ml，依次类推。，依次类推。1.装柱前准备装柱前准备:先用自来水洗净先用自来水洗净,再用蒸馏水洗净再用蒸馏水洗净,之后往层析柱加入之后往层析柱加入2-3ml蒸馏水蒸馏水,以确保凝胶底部没有气泡；以确
26、保凝胶底部没有气泡；2.装柱：垂直装柱，待凝胶装至柱高的装柱：垂直装柱，待凝胶装至柱高的10-15cm即可（装柱的时候注意要不断混匀即可（装柱的时候注意要不断混匀凝胶）。凝胶）。注意防止气泡与分层注意防止气泡与分层,否则重新装柱。可用玻棒搅拌使表面平整；否则重新装柱。可用玻棒搅拌使表面平整；3.平衡：反复加蒸馏水平衡：反复加蒸馏水,平衡平衡10分钟分钟.使蒸馏水维持在使蒸馏水维持在3-4cm高度；高度；4.加样：待蒸馏水流至柱平面时（加样：待蒸馏水流至柱平面时（不可使柱平面干掉不可使柱平面干掉），马上靠近柱平面小心滴加），马上靠近柱平面小心滴加4滴样品（注意滴样品（注意尽量不要使床面搅动尽量不
27、要使床面搅动），待样品浸入到凝胶中后马上加入），待样品浸入到凝胶中后马上加入34滴蒸滴蒸馏水馏水(动作轻柔动作轻柔)，反复两次，然后加大量蒸馏水洗脱；，反复两次，然后加大量蒸馏水洗脱；5.收集样品：样品一旦加入后马上用量筒收集流出液，注意向柱床上不断加水，记收集样品：样品一旦加入后马上用量筒收集流出液，注意向柱床上不断加水，记录红色流出一半时的毫升数（血红蛋白的录红色流出一半时的毫升数（血红蛋白的Ve，也即，也即Vo），继续收集，记录黄色流），继续收集，记录黄色流出一半时体积（鱼精蛋白出一半时体积（鱼精蛋白Ve）；）；实验操作实验操作思考题思考题1.按层析过程的机理分类，按层析过程的机理分类，DNS-氨基酸氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析的双向聚酰胺薄膜层析属于分配属于分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析法的哪一种？试层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析法的哪一种？试述其机理？述其机理？2.经测定甲蛋白经测定甲蛋白Kd=0，乙蛋白，乙蛋白kd=0.75，试问，试问（1）甲乙二蛋白哪一先从）甲乙二蛋白哪一先从凝胶层析柱上洗脱下来？甲乙两蛋白分子量哪个大一些，为什么？凝胶层析柱上洗脱下来？甲乙两蛋白分子量哪个大一些，为什么？