第二章 细胞的破碎.ppt

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1、细胞破碎技术细胞破碎技术 第二章第二章 细胞破碎技术细胞破碎技术第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 第三节第三节 包涵体包涵体第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 细细胞胞壁壁是是微微生生物物菌菌体体比比较较复复杂杂的的结结构构。不不仅仅取取决决于于微微生生物物的的类类型型，还还取取决决于于培培养养发发酵酵液液的的组组成成、细细胞胞所所处处的的生生长长阶阶段段、细细胞胞的的存存储储方方式式以以及及其其它它一一些些因因素素。不不同同微微生生物物菌菌体体细细胞壁的结构有一定差异。胞壁的结构有一定差异。一、细菌一、细菌 细细菌菌的

2、的细细胞胞壁壁坚坚韧韧而而有有弹弹性性，由由不不同同的的肽肽链链结结合合组组成成质质量量均均匀匀的的网网状状结结构构，其其厚厚度度因因细细菌菌不不同同而而有有差差异异，可可抵抵御御外外界的机械损伤，并可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏。界的机械损伤，并可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏。第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 细细胞胞壁壁的的主主要要成成份份是是肽肽聚聚糖糖，由由N N乙乙酰酰葡葡糖糖胺胺（见见图图2-12-1a a）和和N N乙乙酰酰胞胞壁壁酸酸（见见图图2-12-1b b）构构成成双双糖糖单单元元，以以（1-41-4）糖糖苷苷键键连连接接成成大大分分子子。N N

3、乙乙酰酰胞胞壁壁酸酸分分子子上上四四肽肽侧侧链链，相相邻邻葡葡聚聚糖糖纤纤维维之之间间的的短短肽肽通通过过肽肽桥桥或或肽肽键键连连接接起起来来，组组成成机机械械性性很很强强的的网网状状结结构构，像像胶胶合合板板一一样样，粘粘合合成成多多层层。各各种种细细菌菌细细胞胞壁壁酞酞聚聚糖糖结结构构均均相相同同，但但在在四四肽肽侧侧链链的组成及其连接方式上随菌种不同而有差异。的组成及其连接方式上随菌种不同而有差异。革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌细细胞胞壁壁（见见图图2-22-2）较较厚厚，约约20208080nmnm。含含15155050层层肽肽聚聚糖糖片片层层，每每层层厚厚度度1 1nmnm，约约占占细细胞

4、胞干干重重的的50%50%80%80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 图图2-1 细菌细胞壁的主要组分细菌细胞壁的主要组分 第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌细细胞胞壁壁（见见图图2-32-3）细细胞胞壁壁较较薄薄，有有1 12 2层层肽肽聚聚糖糖片片，在在肽肽聚聚糖糖层层外外尚尚有有脂脂蛋蛋白白、脂脂质质双双层层、脂脂多多糖糖三三部部分分。脂脂蛋蛋白白的的功功能能是是将将外外膜膜固固定定于于肽肽聚聚糖糖层层，脂脂类类和和蛋蛋白白质质等等在在稳稳定定细细胞胞结结构构上上非

5、非常常重重要要，如如果果被被抽抽提提，细细胞胞壁壁将将变得很不牢固。变得很不牢固。第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 二、真菌和酵母二、真菌和酵母 真真菌菌的的细细胞胞壁壁含含有有几几丁丁质质（N-N-乙乙酰酰葡葡萄萄糖糖胺胺的的一一种种聚聚合合物物）纤纤维维素素、葡葡聚聚糖糖、甘甘露露聚聚糖糖、半半乳乳聚聚糖糖等等。此此外外还还有有蛋蛋白白质质、类类脂脂、无无机机盐盐等等。而而酵酵母母的的细细胞胞壁壁（见见图图2-42-4）由由特特殊殊的的纤纤丝丝状状物物质质构构成成，主主要要成成份份是是甘甘露露聚聚糖糖（31%31%），葡葡聚聚糖糖（29%29%），蛋蛋白白质质（13%13

6、%）和和类类脂脂质质（8.5%8.5%）。酵酵母母中中的的葡葡聚聚糖糖的的为为 -1-1，6-6-葡葡聚聚糖糖通通过过-1-1，3 3键键与与D-D-葡葡萄萄糖糖中中第第一一侧侧链交连而不溶于水。链交连而不溶于水。所所有有的的真真菌菌细细胞胞壁壁是是由由不不同同的的多多糖糖链链相相互互缠缠绕绕成成一一股股又又粗粗又又壮壮的的链链，嵌嵌入入在在蛋蛋白白质质及及类类脂脂和和一一些些小小分分子子的的多多糖糖基基质质中中，看看起起来来像像钢钢筋筋混混凝凝土土，从从而而解解释释了了真真菌菌细细胞胞壁壁的的机机械械强强度和硬度。度和硬度。第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 三、藻类三、藻类

7、 藻藻类类的的细细胞胞壁壁更更为为复复杂杂，其其主主要要结结构构成成份份，是是纤纤丝丝状状的的多糖类物质。多糖类物质。M-甘露聚糠；P-磷酸二脂键；G-葡聚糠 图2-4 酵母细胞壁的结构示意图 第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 细细胞胞破破碎碎的的方方法法很很多多，在在诸诸多多破破碎碎方方法法中中，机机械械法法中中的的球球磨磨机机和和高高压压匀匀浆浆机机不不仅仅在在实实验验室室而而且且在在工工业业得得到到应应用用。其其它它的的方方法法大大多多尚尚停停留留在在实实验验室室应应用用，工工业业化化的的应应用用还还在在探探索之中。索之中。一、球磨法一、球磨法 球球磨磨机机是是破破碎碎微微生生物物

8、细细胞胞的的常常用用设设备备，一一般般有有立立式式（见见图图2-52-5）或或卧卧式式（见见图图2-62-6）两两种种，在在磨磨腔腔中中装装入入小小玻玻璃璃球球或或小小钢钢球球，由由电电动动机机带带动动搅搅拌拌碟碟片片高高速速搅搅拌拌微微生生物物细细胞胞悬悬浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎。浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 图2-5 Netzsch Molinex KE5搅拌磨 图2-6 Netzsh LM20砂磨机第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎破碎作用遵循一级动力学定律：（2-1）式中 Rt时间内释放的蛋白质数量（mg/g）；Rm100

9、%破 碎 细 胞 释 放 的 蛋 白 质 数 量（mg/g）。k破碎的比速率，s-1；t球磨机工作的时间，s。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 将上式由开始工作到t时刻积分，可得：（2-2）式中 x为R/Rm，t时刻释放蛋白质的分数，x数值越大，表示破碎程度越高。一般用破碎率一般用破碎率Y表示破碎程度。破碎率定义为被破碎表示破碎程度。破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞的百分数。细胞的数量占原始细胞的百分数。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎式中 N0原始细胞数量；N经t时刻操作后保留下来的未受损害完整细胞的数量。N0和N可由直接计数法和间接法求得。直直接接计计数数法法是是直直接接

10、对对稀稀释释后后的的样样品品用用血血球球计计数数器器或或平平板板菌菌落落计计数法进行计数。数法进行计数。间接计数法是在细胞破碎后，将悬浮液离心分离，除去细间接计数法是在细胞破碎后，将悬浮液离心分离，除去细胞碎片，未破碎的细胞及其他悬浮物，然后对清液进行蛋白质胞碎片，未破碎的细胞及其他悬浮物，然后对清液进行蛋白质含量或酶的活性进行分析。通过细胞释放出来的化合物的量含量或酶的活性进行分析。通过细胞释放出来的化合物的量R与所有细胞理论最大释放量与所有细胞理论最大释放量Rm的比值的比值R/Rm，求出破碎率。求出破碎率。（2-3）第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据

11、之一。破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一。在在用用球球磨磨法法破破碎碎细细胞胞的的过过程程中中，影影响响因因素素有有以以下下几几个个方方面：面：（1）搅搅拌拌器器外外缘缘速速率率 搅搅拌拌器器速速度度增增加加，剪剪切切力力增增大大，细细胞胞破破碎碎量量增增大大，但但是是高高的的能能量量消消耗耗，高高的的热热量量产产生生和和磨磨球球的的磨磨损损以以及及因因剪剪切切力力引引起起产产物物失失活活，因因此此对对于于给给定定处处理理量量和和对对蛋蛋白白质质的的释释放放要要求求下下，存存在在着着最最佳佳效效率率点点。实实际际生生产产中中，搅拌器外缘速率控制在（搅拌器外缘速率控制在（515）m/s之间。

12、之间。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 （2）细细胞胞的的浓浓度度 在在细细胞胞破破碎碎过过程程中中，产产生生的的热热量量随随浓浓度度的的增增大大而而提提高高，增增加加了了冷冷却却的的费费用用。因因此此最最佳佳的的细细胞胞浓浓度度由由实实验验来来确确定定。用用NetzshLM20研研磨磨和和破破碎碎酵酵母母或或细细菌菌时时，细胞浓度控制在细胞浓度控制在40%左右。左右。（3）球粒大小和装填量）球粒大小和装填量 磨球越小，细胞破碎速度越快。磨球越小，细胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，难以停留在磨腔中。因此实验室规模的但磨球太小而漂浮，难以停留在磨腔中。因此实验室规模的研磨机中，球径为研磨

13、机中，球径为0.2mm较好；而工业化规模操作中，球径较好；而工业化规模操作中，球径 0.4mm。且不同的细胞，应选择不同的球径。球粒的体积且不同的细胞，应选择不同的球径。球粒的体积占研磨机腔体自由体积的百分比同样影响破碎效果，一般控占研磨机腔体自由体积的百分比同样影响破碎效果，一般控制在制在80%90%之间，并随球粒直径大小而变化。之间，并随球粒直径大小而变化。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 （4 4）温度）温度 操作温度控制在操作温度控制在5 54040范围内对破碎范围内对破碎物影响不大。但在研磨过程中会产生热量积累，为控制磨物影响不大。但在研磨过程中会产生热量积累，为控制磨室温度，

14、在搅拌器和磨室外筒分别设计有冷却夹套，通过室温度，在搅拌器和磨室外筒分别设计有冷却夹套，通过冷却剂来调节磨室的温度。冷却剂来调节磨室的温度。（5 5）流量）流量 高流量有利于降低能耗、降低细胞的破碎高流量有利于降低能耗、降低细胞的破碎程度和释放蛋白质的产量。程度和释放蛋白质的产量。（6 6）微生物特性）微生物特性 一般来说酵母比细菌细胞处理效果一般来说酵母比细菌细胞处理效果好。因为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一，而且细菌细好。因为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一，而且细菌细胞的机械强度比酵母要高。一台胞的机械强度比酵母要高。一台2020L L球磨机在最适条件下，球磨机在最适条件下，每小时可加工每

15、小时可加工200200kgkg面包酵母，而在同样条件下，处理细菌面包酵母，而在同样条件下，处理细菌细胞仅为细胞仅为10102020kgkg。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 二、高压匀浆法二、高压匀浆法 高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要设备是高压匀浆机，它有一个高压位移泵和一个可调节进设备是高压匀浆机，它有一个高压位移泵和一个可调节进料速度的针形阀（见图料速度的针形阀（见图2-72-7）。当菌体悬浮液经过高压泵加）。当菌体悬浮液经过高压泵加压后，通过阀芯与阀座之间的通道时，悬浮液突然改变方压后，通过阀芯与阀座之间的通道时，悬浮液

16、突然改变方向，向球撞击。在通过阀门时产生高剪应力，向环撞击时向，向球撞击。在通过阀门时产生高剪应力，向环撞击时产生巨大的冲击力，将细胞破碎，然后排出。其破碎率服产生巨大的冲击力，将细胞破碎，然后排出。其破碎率服从一级反应定律。从一级反应定律。（2-4）第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 式式中中R为为蛋蛋白白质质释释放放量量；Rm为为蛋蛋白白质质最最大大释释放放量量；N为为悬悬浮浮液液通通过过匀匀浆浆器器的的次次数数；P为为操操作作压压力力；k为为与与温温度度有有关关的的速速度度常常数数；指指数数d值值对对于于有有机机体体是是抵抵抗抗破破碎碎能能力力的的一一种种量量度度，不不同同的有机体其

17、值不同，如酿酒酵母的有机体其值不同，如酿酒酵母d=2.9，大肠杆菌大肠杆菌d=2.21。在高压匀浆机操作中，主要影响因素有：在高压匀浆机操作中，主要影响因素有：图图2-7 高高压压匀匀浆浆机机的的排排出出阀阀装装置置图图 第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 （1）温度 破碎率随着温度的升高而增加。当悬浮液中酵母浓度（450750）kg/m3，操作温度由5提高到30时，破碎率约提高1.5倍。但是高温破碎只适用于非热变性产物，如果温度高于40时，蛋白质在破碎过程中会发生变性。因此，进口处用干冰来调节温度，使出口处的温度维持在20左右。（2）压力 操作压力的合理选择非常重要。提高压力需增加消耗，

18、压力每升高100Mpa会多消耗3.5KW能量；压力每升高10Mpa，温度将提高2；另外压力过高将引起高压匀浆机排出阀座剧烈磨损。通常非结合的酶，操作压力为5.45107Pa，菌体浓度10%20%（质量分数），处理一次即可。在操作压力为55Mpa的条件下，通过6次匀浆假丝酵母得到30%可利用蛋白质。一般来讲，高压匀浆机最适合于酵母和细菌。一般来讲，高压匀浆机最适合于酵母和细菌。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 三、超声破碎法三、超声破碎法 超声破碎法是另一种液相剪切破碎法。其实验室装置见图2-8。图图2-8 连连续续破破碎碎池池的的结结构构简简图图 第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎

19、当通过超声探头向悬浮液输入声能，大量声能转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度，使细胞破碎。在超声波破碎过程中，蛋白质释放遵循一级反应定律：（2-5）式中 x为释放蛋白质的分率；k为蛋白质释放常数,min-1；t为超声波发射时间，min。蛋白质释放常数k取决于输入声能，由实验确定。对于从啤酒酵母悬浮液中(200kg湿重/m3悬浮液)，用190声瓦的20HZ声频的超声波处理时：k=b(P-P0)0.9 （2-6）第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 式中 b为常数；P为输入功率，J/(kg.s)；P0为由超声波引起的空穴的临界功率，J/(kg.s)。当超声波声能通过探头向悬浮液传递能量，

20、当产生的气泡破裂时，绝大部分释放出的能量都以热的形式为液体吸收，为避免高温，在破碎池中设计了冷却水夹套，并在开始时先把悬浮液冷却至05，并不断将冷却液连续通过夹套，短期的声波破碎与短期的冷却交替进行操作，以防止高温使蛋白质变性。为提高破碎效率，在破碎池中可添加细小的球粒（可以是钢制的或玻璃的），以产生“研磨”效应，提高细胞破碎率。超超声声波波破破碎碎是是实实验验室室常常用用的的一一种种普普通通方方法法，由由于于向向大大量量的的悬悬浮浮液液中中输输入入足足够够的的能能量量有有一一定定的的困困难难，因因此此在在工工业业还还未未采用。采用。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 四、酶溶法四、酶溶法

21、 酶酶溶溶法法是是利利用用细细胞胞壁壁水水解解酶酶使使细细胞胞壁壁溶溶解解，释释放放出出胞胞内内物质的方法。根据菌体不同的细胞壁结构选用特定的溶解酶。物质的方法。根据菌体不同的细胞壁结构选用特定的溶解酶。细细胞胞壁壁溶溶解解酶酶有有内内-N-乙乙酰酰壁壁酰酰胺胺酶酶和和内内-N-乙乙酰酰氨氨基基葡葡萄萄糖糖苷苷酶酶，水水解解N-乙乙酰酰壁壁酸酸与与N-乙乙酰酰氨氨基基葡葡萄萄糖糖之之间间的的-1,4键键；N-乙乙酰酰壁壁酸酸-L-丙丙氨氨酸酸酰酰胺胺酶酶系系切切开开肽肽聚聚糖糖与与肽肽之之间间结结合合点点的的酶酶，又又称称自自溶溶素素，在在微微生生物物细细胞胞的的自自溶溶上上起起着着重重要要的

22、的作作用用。酞酞酶酶切切开开肽肽聚聚糖糖中中肽肽段段部部分分的的肽肽键键，单单独独存存在在时时有有一一定定的的溶溶菌菌作作用用，而而在在有有葡葡聚聚糖糖酶酶共共存存时时有有明明显显可可促促进进真真菌菌细细胞胞壁壁的的溶溶解解。针针对对细细菌菌细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成，使使用用酶酶溶溶解解细细菌菌细细胞胞壁壁时时，通通常常选选用用两两种种以以上上的的酶酶协协同同作作用用，使使溶溶解解作作用增强。用增强。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 酵酵母母细细胞胞壁壁溶溶解解酶酶主主要要成成份份是是-1,3葡葡聚聚糖糖酶酶，当当它它与与磷磷酸酸甘甘露露聚聚糖糖酶酶、蛋蛋白白酶酶同同时时作作

23、用用时时，对对溶溶解解酵酵母母的的作作用用显显著著增增强强。而而-1,3葡葡聚聚糖糖酶酶与与甲甲壳壳质质酶酶协协同同作作用用时时可可溶溶解解由由甲壳质和葡聚糖构成的霉菌细胞壁。甲壳质和葡聚糖构成的霉菌细胞壁。酶酶溶溶法法的的优优点点有有：对对设设备备的的要要求求低低，能能耗耗小小；抽抽提提的的速速率率和和收收率率高高；产产品品的的完完整整性性好好；对对pH值值和和温温度度等等外外界界条条件件要要求求低低；由由于于细细胞胞壁壁被被溶溶解解，不不残残留留碎碎片片，有有利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 五、化学渗透法五、化

24、学渗透法 用用某某些些化化学学试试剂剂溶溶解解细细胞胞壁壁或或抽抽提提细细胞胞中中某某些些组组分分的的方方法法称称为为化化学学渗渗透透法法。例例如如在在发发酵酵液液中中添添加加酸酸碱碱、脂脂溶溶性性有有机机溶溶剂剂（甲甲苯苯、丁丁醇醇、丙丙酮酮、氯氯仿仿等等）和和某某些些表表面面活活性性剂剂，改改变变菌菌体细胞壁或膜的通透性，使细胞壁破裂，使胞内物质释放出来。体细胞壁或膜的通透性，使细胞壁破裂，使胞内物质释放出来。酸酸碱碱用用来来调调节节溶溶液液的的pH值值，改改变变细细胞胞所所处处的的环环境境，从从而而改改变变两两性性产产物物蛋蛋白白质质的的电电荷荷性性质质，使使蛋蛋白白质质和和蛋蛋白白质质

25、之之间间或或蛋蛋白白质质与与其其他他物物质质之之间间的的作作用用力力降降低低而而溶溶解解到到液液相相中中去去，便便于于后面的提取。后面的提取。有有机机溶溶剂剂被被细细胞胞壁壁吸吸收收后后，会会使使细细胞胞壁壁膨膨胀胀或或溶溶解解，导导致致破破裂裂，把把胞胞内内产产物物释释放放到到水水相相中中去去。选选用用溶溶剂剂的的基基本本原原则则是是与与细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶剂细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶剂。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 表表面面活活性性剂剂是是指指不不仅仅能能溶溶于于水水或或其其他他有有机机溶溶剂剂，同同时时又又能能在在相相界界面

26、面上上定定向向并并改改变变界界面面的的性性质质的的某某些些有有机机化化合合物物。表表面面活活性性剂剂分分子子中中间间同同时时具具有有憎憎水水基基团团和和亲亲水水基基团团，当当表表面面活活性性剂剂溶溶质质或或溶溶剂剂中中的的浓浓度度达达到到一一定定时时，它它的的分分子子会会产产生生聚聚集集生生成成胶胶束束，憎憎水水端端向向内内，亲亲水水端端向向外外。憎憎水水基基团团聚聚集集在在胶胶束束内内部部将将溶溶解解的的脂脂蛋蛋白白包包在在中中心心，而而亲亲水水基基团团则则向向外外层层，使使膜膜的的通通透透性性改改变变或或使使细细胞胞壁壁溶溶解解，从从而而使使胞胞内内物物质质释释放放到到水水相相中中。此此法

27、法特特别别适适用用于于膜膜结结合合蛋蛋白白酶酶的的溶溶解解。表表面面活活性性剂剂按按分分子子结结构构中中带带电电性性的的特特征征可可分分为为：阴阴离离子子型型（如如直直链链烷烷基基苯苯磺磺酸酸盐盐），亲亲水水基基团团带带有有负负电电荷荷；非非离离子子型型，如如碳碳原原子子数数在在12以以上上的的高高碳碳脂脂肪肪醇醇，在在分分子子中中没没有有带带电电荷荷的的基基团团，其其水水溶溶性性来来自自于于分分子子中中所所具具有有的的聚聚氧氧乙乙烯烯醚醚基基和和端端点点羟羟基基；阳阳离离子子表表面面活活性性剂剂，亲亲水水基基团团带带有有正正电电荷荷；两两性性表表面面活活性性剂剂，在在水水中中同同时时具具有有

28、可可溶溶于于水水中中的的正正电电性性和和负负电电性性基基团团。一一般般来来说，使用离子型表面活性剂比非离子型提取效果要好一些。说，使用离子型表面活性剂比非离子型提取效果要好一些。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 六、其它方法六、其它方法 除上述各种方法外，常用的方法还有以下几种。除上述各种方法外，常用的方法还有以下几种。（1）反反复复冻冻融融法法 将将待待破破碎碎细细胞胞在在15至至20条条件件下下冷冷冻冻，然然后后在在室室温温下下融融化化，冷冷冻冻时时膜膜的的疏疏水水键键被被破破碎碎而而疏疏水水性性增增强强，胞胞内内水水形形成成冰冰晶晶粒粒而而使使细细胞胞内内盐盐分分浓浓度度加加大大，

29、反反复冻融多次，使细胞破裂将胞内物质释放出来。复冻融多次，使细胞破裂将胞内物质释放出来。（2）干干燥燥法法 将将待待破破碎碎细细胞胞用用不不同同方方法法进进行行干干燥燥，菌菌体体细细胞胞失失水水，细细胞胞内内盐盐分分浓浓度度增增大大，细细胞胞渗渗透透性性发发生生变变化化，然然后后用用丙丙酮酮，乙乙醇醇或或缓缓冲冲溶溶液液等等溶溶剂剂抽抽提提胞胞内内物物质质。干干燥燥的的方方法法有有空空气气干干燥燥、真真空空干干燥燥、冷冷冻冻干干燥燥等等。对对不不稳稳定定生生化化物物质质进进行行干干燥燥时时，常常加加入入半半胱胱胺胺酸酸，巯巯基基乙乙醇醇和和亚亚硫硫酸酸钠钠等等还还原原剂剂进行保护。进行保护。第

30、二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 （3 3）渗渗透透压压冲冲击击法法 将将两两种种不不同同成成分分或或不不同同浓浓度度的的溶溶液液，中中间间用用半半透透膜膜隔隔开开，则则两两种种溶溶液液因因性性质质不不同同可可由由一一方方向向另另一一方方渗渗透透，这这种种现现象象叫叫渗渗透透现现象象，其其推推动动力力是是渗渗透透压压。菌菌体体细细胞胞膜膜是是天天然然半半透透膜膜，把把待待破破碎碎细细胞胞经经一一定定浓浓度度甘甘油油或或蔗蔗糖糖溶溶液液处处理理，在在高高渗渗压压溶溶液液中中细细胞胞脱脱水水，细细胞胞质质变变稠稠，发发生生质质壁壁分分离离。然然后后转转入入低低渗渗透透压压溶溶液液中中或或缓缓冲

31、冲溶溶液液中中，细细胞胞快快速速吸吸水水膨膨胀胀而而破破裂裂，使使胞胞内内物物释释放放到到溶溶液液中中。用用此此法法处处理理大大肠肠杆杆菌菌时时，可可使使磷磷酸酸脂脂酶酶、核核糖糖核核酸酸酶酶和和脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸酶酶等等释释放放至至溶溶液液中中。蛋蛋白白质质释释放放量量一一般般为为菌菌体体蛋蛋白白总量的总量的4%4%7%7%。但此法对革兰氏阳性菌不适用。但此法对革兰氏阳性菌不适用。第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎（4 4）冷冷热热交交替替法法 将将待待破破碎碎细细胞胞在在9090维维持持数数分分钟钟，立立即即放放入入冰冰水水浴浴使使之之冷冷却却，如如此此反反复复多多次次，绝绝大大

32、部部分分细细胞胞可可以以被被破破碎碎。从从细细菌菌或或病病毒毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。中提取蛋白质和核酸时可用此法。无无论论是是运运用用机机械械法法还还是是非非机机械械法法都都要要既既能能破破坏坏微微生生物物菌菌体体的的细细胞胞壁壁，又又要要得得到到不不发发生生变变性性的的蛋蛋白白产产物物。因因此此，选选择择合合理理的的破破碎碎方方法法非非常常重重要要，通常选择破碎方法遵循以下一般原则：通常选择破碎方法遵循以下一般原则：提取的产物在细胞质内，选用机械破碎法；提取的产物在细胞质内，选用机械破碎法；在细胞膜附近则可用温和的非机械法；在细胞膜附近则可用温和的非机械法；提提取取的的产产物物与与细

33、细胞胞壁壁或或膜膜相相结结合合时时，可可采采用用机机械械法法和和化化学学法法相相结结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件；合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件；为为提提高高破破碎碎率率，可可采采用用机机械械法法和和非非机机械械法法相相结结合合的的方方法法。如如面面包包酵酵母母的的破破碎碎，可可先先用用细细胞胞壁壁溶溶解解酶酶予予处处理理，然然后后用用高高压压匀匀浆浆机机在在9595MpaMpa压压力力下下匀匀浆浆四四次次，总总破破碎碎率率可可接接近近100%100%，而而单单独独用用高高压压匀匀浆浆机机破破碎碎率率只只有有32%32%。第三节第三节 包涵体包涵体 利利用用D

34、NADNA重重组组技技术术，把把重重组组体体DNADNA引引入入宿宿主主细细胞胞，使使其其在在细细胞胞内内表表达达，便便可可得得到到一一定定的的蛋蛋白白质质。目目前前已已成成功功的的利利用用大大肠肠杆杆菌菌发发酵酵生生产产胰胰岛岛素素，人人的的生生长长激激素素，人人胸胸腺腺激激素素1 1，、干干扰扰素素，牛牛生生长长激激素素，乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒抗抗原原和和口口啼啼疫疫病病毒毒抗抗原原等等。外外源源基基因因在在大大肠肠杆杆菌菌中中的的高高表表达达常常常常导导致致包包涵涵体体的的形形成成。所所谓谓包包涵涵体体是是指指蛋蛋白白质质分分子子本本身身及及与与其其周周围围的的杂杂蛋蛋白白、核核酸酸等

35、等形形成成不不溶溶性性的的，无无活活性性的的聚聚集集体体，其其中中大大部部分分是是克克隆隆表表达达的的目目标标产产物物蛋蛋白白。这这些些目目标标产产物物蛋蛋白白在在一一级级结结构构上上是是正正确确的的，但但在在立立体体结结构构上上却却是是错错误误的的，因因此此没没有有生生物物活活性性。在在利利用用大大肠肠杆杆菌菌生生产产蛋蛋白白的的过过程程中中，重重组组蛋蛋白白大大多多数数情情况况是是以以包包涵涵体体形形式式存存在在。要要从从包包涵涵体体中中分分离离出出具具有有生生物物活活性性的的产产物物，通通常常的的处处理理步步骤骤为为：收收集集菌菌体体细细胞胞细细胞胞破破碎碎离离心心分分离离包包涵涵体体的

36、的洗洗涤涤目目标标蛋蛋白白的的变变性性溶溶解解目目标标蛋蛋白的复性。白的复性。第三节第三节 包涵体包涵体 一、包涵体的形成、分离及洗涤一、包涵体的形成、分离及洗涤 形成包涵体的因素主要有以下几个方面：形成包涵体的因素主要有以下几个方面：重重组组蛋蛋白白的的表表达达率率过过高高，超超过过了了细细菌菌的的正正常常代代谢谢，由由于于细细菌菌的的蛋蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来；白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来；由由于于合合成成速速度度太太快快，以以致致没没有有足足够够时时间间进进行行肽肽链链折折叠叠，二二硫硫键键不不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小；能正确配对，

37、导致重组蛋白溶解度变小；与与重重组组蛋蛋白白的的氨氨基基酸酸组组成成有有关关，一一般般说说含含硫硫氨氨基基酸酸越越高高越越易易形形成成包涵体；包涵体；重重组组蛋蛋白白是是宿宿主主菌菌的的异异源源蛋蛋白白，大大量量生生成成后后，缺缺乏乏后后修修饰饰所所需需酶酶类和辅助因子，如折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀；类和辅助因子，如折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀；与重组蛋白的本身的溶解性有关；与重组蛋白的本身的溶解性有关；在在细细菌菌分分泌泌的的某某个个阶阶段段，蛋蛋白白质质间间的的离离子子键键、疏疏水水键键或或共共价价键键等等化学作用导致了包涵体形成。化学作用导致了包涵体

38、形成。第三节第三节 包涵体包涵体 由由于于重重组组蛋蛋白白形形成成包包涵涵体体，包包涵涵体体又又位位于于细细胞胞质质中中，因因此此可可选选择择破破碎碎细细胞胞的的方方法法，得得到到包包涵涵体体。例例如如人人干干扰扰素素的的 提提 取取 中中，先先 把把 发发 酵酵 液液 冷冷 却却 至至 1010以以 下下，离离 心心（40004000r/minr/min）分分离离，除除去去上上层层清清液液，得得到到菌菌体体，将将细细胞胞悬悬浮浮于于1010倍倍体体积积PBSPBS缓缓冲冲溶溶液液中中，于于冰冰浴浴下下进进行行超超声声破破碎碎，反反复复 5 5次次，每每 次次 5 5s s，离离 心心（400

39、04000r/minr/min）分分 离离 后后，用用0.1%0.1%TritonX-100TritonX-100的的溶溶液液充充分分搅搅拌拌均均匀匀，进进行行洗洗涤涤。洗洗涤涤三三次次后后，离离心心（1000010000r/min20r/min20分分钟钟），可可得得到到包包涵涵体体。细细胞胞破破碎碎后后离离心心分分离离的的包包涵涵体体沉沉淀淀物物中中，除除目目标标蛋蛋白白质质外外，还还有有其其他他蛋蛋白白质质、核核酸酸等等的的存存在在，经经过过洗洗涤涤，可可以以除除去去吸吸附附在在包包涵涵体体表表面面的的不不溶溶性性杂杂蛋蛋白白、膜膜碎碎片片等等，达达到到纯纯化化包包涵涵体体的的目目的的。

40、洗洗涤涤多多采采用用较较温温和和的的表表面面活活性性剂剂（如如TritonX-100TritonX-100）或或低低浓浓度度的的弱弱变变性性剂剂（如如尿尿素素）等等。洗洗涤涤剂剂的的浓浓度度非非常常重重要要，通通常常不要太高，以免包涵体也发生溶解。不要太高，以免包涵体也发生溶解。第三节第三节 包涵体包涵体 二、包涵体的变性溶解二、包涵体的变性溶解 包包涵涵体体中中不不溶溶性性的的活活性性蛋蛋白白产产物物必必须须溶溶解解到到液液相相中中，才才能能采采用用各各种种手手段段使使其其得得到到进进一一步步纯纯化化。一一般般的的水水溶溶液液很很难难将将其其溶溶解解，只只有有采采用用蛋蛋白白质质变变性性的的

41、方方法法才才能能使使其其形形成成可可溶溶性性的的形形式式。常常用用的的变变性性增增溶溶剂剂有有十十二二烷烷磺磺酸酸钠钠（SDSSDS）、尿尿素素、有机溶剂（乙腈、丙酮）、有机溶剂（乙腈、丙酮）、pHpH9.09.0的碱溶液或盐酸胍等。的碱溶液或盐酸胍等。十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠（SDSSDS）是是曾曾经经广广泛泛使使用用的的变变性性剂剂。它它可可在在低低浓浓度度下下溶溶解解包包涵涵体体，主主要要是是破破坏坏蛋蛋白白质质肽肽链链间间的的疏疏水水相相互互作作用用。但但是是结结合合在在蛋蛋白白质质上上的的SDSSDS分分子子难难以以除除去去。一一般般SDSSDS的使用浓度为的使用浓度为1%1%2

42、%2%（w/vw/v）。）。第三节第三节 包涵体包涵体 尿尿素素和和盐盐酸酸胍胍可可打打断断包包涵涵体体内内的的化化学学键键和和氢氢键键。用用（8 81010）mol/L mol/L 的的尿尿素素溶溶解解包包涵涵体体，其其溶溶解解速速度度较较慢慢，溶溶解解度度为为70%70%90%90%。在在复复性性后后除除去去尿尿素素不不会会造造成成蛋蛋白白质质的的严严重重损损失失，同同时时还还可可选选用用多多种种层层析析方方法法对对提提取取到到的的包包涵涵体体进进行行纯纯化化。但但用用尿尿素素溶溶解解对对蛋蛋白白质质很很难难恢恢复复活活性性。盐盐酸酸胍胍对对包包涵涵体体的的溶溶解解效效率率很很高高，达达9

43、5%95%以以上上，溶溶解解速速度度快快。缺缺点点在在于于成成本本较较高高，且且除除去去盐盐酸酸胍胍时时，蛋蛋白白质质会会有有较较大大的的损损失失，而而且且盐盐酸酸胍胍对对后后期期离离子子交交换换提纯有干扰作用。提纯有干扰作用。对对于于含含有有半半胱胱氨氨酸酸的的蛋蛋白白质质，其其包包涵涵体体形形式式通通常常含含有有链链间间形形成成错错配配的的无无活活性性的的二二硫硫键键，因因此此还还要要加加入入还还原原剂剂使使二二硫硫键键处处于于可可逆逆断断裂裂状状态态。常常用用的的还还原原剂剂有有二二巯巯基基乙乙醇醇（2-2-MEME）、二二硫硫基基苏苏糖糖醇醇（DTTDTT）、二二硫硫赤赤藓藓糖糖醇醇、

44、半半胱胱胺胺酸酸等等。对对于于目目标标蛋蛋白白无无二二硫硫键键的的包包涵涵体体加加入入还还原原剂剂也也有有增增溶溶作作用用，可可能能是是含含有有二二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。第三节第三节 包涵体包涵体 三、蛋白质的复性三、蛋白质的复性 由由于于包包涵涵体体中中的的重重组组蛋蛋白白缺缺乏乏生生物物活活性性，加加上上剧剧烈烈的的处处理理条条件件，使使蛋蛋白白质质的的高高级级结结构构破破坏坏，因因此此蛋蛋白白质质的的复复性性特特别别重重要要。所所谓谓复复性性是是指指变变性性的的包包涵涵体体蛋蛋白白质质在在适适当当条条件件下下使使伸伸展展的的肽肽键键形形成成特特定

45、定三三维维结结构构，使使无无活活性性的的分分子子成成为为具具有有特特定定生生物物学学功功能能的的蛋蛋白白质质。其其操操作作方方法法是是用用透透析析法法或或超超滤滤法法，缓缓慢慢除除去去变变性性液液中中多多余余的的变变性性剂剂和和还还原原剂剂，使使伸伸展展的的肽肽链链恢恢复复到到正正常常折折叠叠状状态态，错错误误的的二二硫硫键键进进行行正正常常链链接接。也也可可采采用用稀稀释释复复性性的的方方法法，直直接接加加入入水水或或与与变变性性液液相相同同的的、不不含含还还原原剂剂的的缓缓冲冲溶溶液液，改改变变蛋蛋白白质质分分子子周周围围溶溶剂剂的的性性质质，促促进进肽肽链链正正常常折折叠叠和和二二硫硫键

46、键重重新新组组合合。人人-干干扰扰素素的的复复性性操操作作中中，就就是是将将变变性性溶溶液液用用5050mmolmmol/L/L的的Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲溶溶液液稀稀释释100100倍倍，使使尿尿素素浓浓度度小小于于0.10.1mol/L,mol/L,在在44下下搅搅拌拌2424小小时时，即即可可完完成成蛋蛋白质的重折叠过程。白质的重折叠过程。复复性性过过程程是是一一个个十十分分复复杂杂的的过过程程，迄迄今今为为止止包包涵涵体体形形成成和和复复性性过过程程中中发发生生聚聚集集的的机机理理尚尚不不清清楚楚，已已建建立立的的高高效效复复性性方方法法是是在在反反复复实实验验和和优优化的基础上建立的，因此具体操作中要不断探索最适用的条件。化的基础上建立的，因此具体操作中要不断探索最适用的条件。