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1、第六章第六章 酶的提取和分离纯化酶的提取和分离纯化1、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法GoGoGoGo5、酶的组合分离纯化策略Go6、酶的浓缩、干燥与结晶Go第一节第一节 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶酶提取提取酶酶分离纯化分离纯化酶酶浓缩浓缩酶酶贮存贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。酶酶的纯化过程，约可分为三的纯化过程，约可分为三个阶段：个阶段：(1)
2、粗蛋白质粗蛋白质(crude protein):采样采样 均质打破细胞均质打破细胞 抽抽出全蛋白，多使用出全蛋白，多使用 盐析沉淀盐析沉淀法法；可以粗略去除蛋白质以；可以粗略去除蛋白质以外的物质。外的物质。(2)部分纯化部分纯化(partially purified):初步的纯化，使用初步的纯化，使用各钟各钟 柱层析法柱层析法。(3)均质酶均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，目标酶的进一步精制纯化，可用可用制备式电泳制备式电泳 或或 HPLC。酶分离纯化不同阶段酶分离纯化不同阶段本章目录第二节：细胞破碎第二节：细胞破碎许多酶存在于细胞内。为许多酶存在于细胞内。为了提取这些
3、胞内酶，首先了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。需要对细胞进行破碎处理。1 1）机械破碎）机械破碎2 2）物理破碎）物理破碎3 3）化学破碎）化学破碎4 4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机细胞胞破破碎碎珠珠高高压细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀玻璃匀浆机机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用
4、，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理本章目录进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于铝等研磨剂（直径小于1mm1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、）一起快
5、速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。冷却的方式带走。1.珠磨法（珠磨法（Bead mill）原理：原理：n实验室规模的细胞破碎设备有实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、高速组织捣碎机、Braun匀浆器；匀浆器；n中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；中试规模的细胞破碎可
6、采用胶质磨处理；n在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德公司和德国西门子机械公司制造）。国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。易分离而给后续操作带来的困难。采用采用高压匀浆器高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司公司和美国和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。公司均有产品出售
7、）。2.高压匀浆法（高压匀浆法（High-pressure homogenization）大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从
8、而造成过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。细胞破碎。原理：原理：在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。p易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，p较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，p含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）含有包含体的基因工程
9、菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）不宜采用高压匀浆法。不宜采用高压匀浆法。在在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。）引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。3
10、.超声破碎法（超声破碎法（Ultrasonication）一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，效果较差，该法该法在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。4.酶溶法（酶溶法（Enzymatic Lysis）（1）外加酶法）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白
11、酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等溶菌酶主要用于细菌类溶菌酶主要用于细菌类细胞壁溶解酶是几种酶的复合物细胞壁溶解酶是几种酶的复合物对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。胞内产物。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学利用溶
12、酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序组成选择适当的酶，并确定相应的次序组成选择适当的酶，并确定相应的次序组成选择适当的酶，并确定相应的次序。酶溶法的优点：酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。的酶），产物抑制的存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作
13、用，葡聚糖抑制葡在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。聚糖酶。u诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。活力，以达到细胞自溶的目的。u影响自溶过程的主要因素有温度、时间、影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pHpH值、激值、激活剂和细胞代谢途径等。活剂和细胞代谢途径等。u缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。（2）自溶法（）自溶法（Autolysis）某些化
14、学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。4.化学渗透法（化学渗透法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。如如Triton X-100是一种非离子型清洁剂是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子很强的
15、亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。层，使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可等也可使细胞破碎。使细胞破碎。（1 1）表面活性剂）表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。处理处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子构通常靠二价阳离子Ca2+或或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦一旦EDTA将将C
16、a2+或或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。从而导致内层膜通透性的增强。（2）EDTA螯合剂螯合剂能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。胞内物质被释放出来。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。（3）有机溶剂）有机溶剂（4）变性剂）变性剂盐酸胍（盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（）和脲（Urea）
17、是常用的）是常用的变性剂。变性剂。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。使疏水性化合物溶于水溶液。u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%50%；u有些化学试剂有毒有些化学试剂有毒 。化学渗透法优点：化学渗透法优点：缺点：缺点：l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞
18、留在胞内；留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。步提取。将浓缩的菌体悬浮液冷却至将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，
19、但不适应于对冷冻敏感的生化物质。活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。5.其他方法其他方法1.X-press法法将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素
20、等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。2.渗透压法（渗透压法（Osmotic pressure）将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多
21、次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。过程中可能引起某些蛋白质变性。3.3.反复冻结反复冻结-融化法融化法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。4.干燥法干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥三、破碎率的测定与破碎
22、技术的研究方向三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向 细细胞胞破破碎碎后后，大大量量带带电电荷荷的的内内含含物物被被释释放放到到水水相相，使导电率上升。使导电率上升。1.1.破碎率的测定破碎率的测定1)1)直接测定法直接测定法2)2)目的产物测定法目的产物测定法3)3)导电率测定法导电率测定法采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈
23、亮红色。而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%100%破碎率所获得的标破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。准数值比较，计算其破碎率。细胞破碎与固液分离紧密相关。细胞破碎与固液分离紧密相关。2.2.破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向1)1)多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合2)2)与上游过程相结合与上游过程相结合3)3)与下游工程相结合与下游工程相结合化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。如用
24、溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa95MPa压压力下匀浆力下匀浆4 4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%100%。而单独采用高压匀。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有浆法，同样条件下破碎率只有32%32%。v在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pHpH、温温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。v此外，
25、用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的此外，用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。提取率也是非常重要的。v在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；v选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；v在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温在细胞内引进噬菌体
26、基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。物。v定义：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。v原则：酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。第三节第三节 酶的提取酶的提取v酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取稀盐
27、溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。v提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。v为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶较大的酶酸溶液提取酸溶液提取pH26的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸
28、溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取pH812的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶稳定性较好的酶有机溶剂提取有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶有较多非极性基团的酶本章目录大多数蛋白类大多数蛋白类酶都溶于水，酶都溶于水，而且在而且在低浓度低浓度的盐存在的条的盐存在的条件下，酶的溶件下，酶的溶解度随盐浓度解度随盐浓度的升高而增加，的升高而增加，这称为这称为盐溶现盐溶现象象。+=-+=-盐溶液提取盐溶液提取（盐溶（盐溶
29、 Salting-in）：Ionic strength溶溶解解度度+-NaClNaClKCl-+-+-+-+-+-分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。酸溶液提取酸溶液提取v有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，易用酸溶液提取。注意事项：pH值不能过低，以免使酶变性失活。碱溶液提取碱溶液提取v有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，应采用碱溶液提取。注意事项：pH值不能过高，以免使酶变性失活。有机溶液提取有机溶液提取v有些酶与脂质物质结
30、合牢固，或含有较多的非极性集团，可以采用与水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。注意事项：pH值不能过低，以免使酶变性失活。影响酶提取的主要因素温度温度 在适当的范围内，提高温度可以加快酶的提取；pH 避免在等电点；提取液的体积提取液的体积 增加提取液的用量，可以提高酶的提取率；但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步分离纯化不利第四节第四节 酶的分离方法酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go6、萃取分离Go本章目录 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室
31、中。法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。一、沉淀分离一、沉淀分离1、定义：沉淀分离是通过改变某些条件或添加某、定义：沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。出，与其它溶质分离的技术过程。l由于其由于其浓缩浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。层分离等
32、方法进一步提高其纯度。l沉淀法由于成本低、收率高沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子不会使蛋白质等大分子失活失活)、浓缩倍数高可达、浓缩倍数高可达l0-50倍和操作简单等优点，倍和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。2、沉淀的种类沉淀的种类盐析沉淀法盐析沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀热沉淀法热沉淀法复合沉淀法复合沉淀法选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法1、盐析沉淀法沉淀法（一）定义：是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从
33、而使酶与杂质分离的过程。（二）原理1.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱电排斥作用减弱.2.2.中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子质争夺水分子.蛋白质表面特性蛋白质溶解：蛋白质溶解：相似者相溶亲水性和疏水性：亲水性和疏水性：有利因素：有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白不利因素：不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的%等。如纤维蛋白原。盐析的基本原理图三、盐析剂中性盐的选择v盐析常用的中性盐：硫酸铵最常用。v其优点
34、是：溶解度大，25时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L;0时饱和溶解度为3.9mol/L,即676g/L，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以析出来；分段效果比其它盐好，不容易引起其它蛋白质变性；价廉易得。四、盐析剂用量的确定v例：以硫酸铵盐析糖化酶 糖化酶的盐析曲线五、分部盐析法v1.分部盐析法v2.盐析曲线 3.两种酶的分离六.盐析的影响因素1.蛋白质的种类 蛋白质的种类不同，蛋白质的种类不同，Ks（盐析系数）值会有（盐析系数）值会有所不同；所不同；分子量越大，沉淀所需盐的量越少；分子量越大，沉淀所需盐的量越少；2.蛋白质的初始浓度不同浓度的蛋白质溶液产生沉淀所要求的临不同浓
35、度的蛋白质溶液产生沉淀所要求的临界盐浓度不同。界盐浓度不同。蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少、蛋共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少、蛋白质的溶解损失小。白质的溶解损失小。相反，蛋白质浓度低时，中性盐的极限沉淀相反，蛋白质浓度低时，中性盐的极限沉淀浓度高，共沉作用小，分辨率高，但用盐量浓度高，共沉作用小，分辨率高，但用盐量增大、蛋白质的回收率低增大、蛋白质的回收率低。3.无机盐种类 阴离子盐析作用顺序柠檬酸盐PO43SO42CH3COOClNO3SCN阳离子盐析作用顺序（一价）NH4+K+Na(NH4)2SO44.
36、温度 在高离子强度溶液中，升高温度有利于在高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水，使之溶解度下降。蛋白质的失水，使之溶解度下降。在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。大。5.pH值 在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移。2、等电点沉淀法等电点沉淀法v等电点定义；等电点定义；v在等电点时溶液的性质；在等电点时溶液的性质；
37、3.有机溶剂沉淀法 蛋白质和酶的水溶液，在逐渐加入乙醇、丙酮等有机溶剂后，其溶解度可不同程度地显著降低，从溶液中沉淀出来。这种向水溶液中加入与水混溶的有机溶剂，使生物大分子溶解度降低而分组沉淀的方法，称为有机溶剂分级沉淀法。（一）：有机溶剂沉淀法原理（一）：有机溶剂沉淀法原理1.有机溶剂有较低的介电常数，会使溶液介电常数减小，增强偶极离子之间的静电引力从而使分子集聚而沉淀。2.有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也促使蛋白质分子脱水而沉淀。相距为r的两个点，电荷q1和q2互相作用的静电力F可以下式表示：K：由介质的特性决定，称为介电常数，在真空中定为1,介电常数表示介质对带有相反电
38、荷的微粒之间的静电引力与在真空中对比减弱的倍数。蛋白质和酶是极性分子，其分子间有静电引力，水也是极性分子，能减弱蛋白质等分子间的作用力，使蛋白质较易溶解，所以水是蛋白质等极性物质的较好溶剂。在蛋白质和油等极性物质的水溶液中加入乙醇、丙酮等与水溶性的有机溶剂可降低介电常数，因而降低了蛋白质和酶的溶解度而使之沉淀。特点 有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。比盐析更易使蛋白变性，需低温
39、操作。注意事项：注意事项：(1)(1)有机溶剂的选择有机溶剂的选择 乙醇和丙酮是两种最常用的有机溶剂，丙酮比乙醇的介电常数小些，即丙酮的沉淀能力较强。根据一般经验，如30一40左右乙醇沉淀的物质，改用丙酮时浓度可减少10左右，即用20一30的丙酮。（2）温度的控制）温度的控制 有机溶剂沉淀的操作过程宜在低温进行，而且最好在同一温度下进行。加入的有机溶剂温度要预冷到比操作温度更低，因有机溶剂与水混溶时要放热。在加入有机溶剂时搅拌要均匀适当，以避免局部浓度过高和温度过高而导致的不良影响.（3）离子强度的控制）离子强度的控制 离子强度在有机溶剂和水的混合液中是一个特别重要的因素。有时当离子强度很小时
40、，物质不能沉淀，如补加少量电解质即可解决。一般可用醋酸铵、醋酸钠或氯化钠等以溶剂能溶解且不影响提取物的质量为原则。当盐的离子强度达到一定程度时，能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。(4)pH值的控制值的控制 pH值影响蛋白质等在有机溶剂中的溶解度。蛋白质等分级沉淀更应严格控制pH值。有时为了防止带相反电荷的蛋白质之间的相互结合，选择pH值时可使大部分蛋白质带有相同的净电荷。(5)待分离物质的浓度控制待分离物质的浓度控制 蛋白质等物质浓度越大，加入有机溶剂后，由于溶解降低所引起的浓度差值也越大，蛋白质等沉淀量就越多。此外蛋白质等浓度大时，可减少变性，节省有机溶剂用量。（6）金属离子的影响 金属
41、离子与蛋白质结合，其结果常使蛋白质的溶解度降低。利用金属离子与生物大分子的反应，常有助于生物大分子的分组分离。例如，有些蛋白质与锌离子等，可形成复合物，这种复合物在水和有机溶剂的混合物中的溶解度较低，易于形成结晶。四、实例v有机溶有机溶剂沉淀剂沉淀法制取法制取食品级食品级-淀粉淀粉酶酶工艺流程说明：工艺流程说明：1.发酵液预处理 2.压滤3.浓缩 4.沉淀5.压滤 6.干燥4.热沉淀定义 在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳
42、定性性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。高的目标产物。适用对象：热稳定性高的蛋白质热稳定性高的蛋白质5、复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。二、离心分离二、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离心机常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中
43、，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min，相对离心力达到 11041105 g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之谓之高速冷冻离心机。高速冷冻离心机。超速离心机超速离心机的最大转速达(2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数
44、和相对分子质量的测定等。1、离心方法的选择v对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。v超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心 v1、差速离心v采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分分批批分分离离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。2 密度梯度离心v样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。v密度梯度系统：梯度介质有足够大的溶解度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝集、变性或失活。v常用介质：蔗糖、甘油等。v样品铺在密度梯度溶液表面，离心后形成若干
45、条界面清楚的不连续区带。3 等密度离心等密度离心v当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的物质颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置（等密度点），形成区带。v等密度离心常用的介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr三、过滤与膜分离三、过滤与膜分离过滤是借助于过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。属和各种高分子膜等，可
46、以根据需要选用。过滤过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)类别类别截留颗粒大小截留颗粒大小截留的主要物质截留的主要物质过滤介质过滤介质粗滤粗滤 2m酵母、霉菌、动物细胞、酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧维多孔陶瓷、烧结金属等结金属等微滤微滤0.22m细菌、灰尘等细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶微滤膜、微
47、孔陶瓷瓷超滤超滤200.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超滤膜超滤膜反渗反渗透透 20生物小分子、盐、离子生物小分子、盐、离子 反渗透膜反渗透膜 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄
48、膜的作用是选择性地让小于其孔径的膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。有多种规格可供使用时选择。膜分离膜分离加压膜分离加压膜分离 微滤微滤超滤超滤反渗透反渗透电场膜分离电场膜分离 电渗析电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 扩散膜分离扩散膜分离 透析透析四、层析分离四、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度理化学性质的差别，使各组分以不同程度分
49、布在两个相中，其中一个相为固定的分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相称为固定相)，另一个相则流过此固定相，另一个相则流过此固定相(称为流动相称为流动相)并使各组分以不同速度移动，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。从而达到分离。层析分离方法层析分离方法 层析方法层析方法分离依据分离依据吸附层析吸附层析利用吸附剂对不同物质的利用吸附剂对不同物质的吸附力吸附力不同而使混合物中不同而使混合物中各组分分离各组分分离分配层析分配层析利用各组分在两相中的利用各组分在两相中的分配系数分配系数不同，而使各组分不同，而使各组分分离分离离子交换层析离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）
50、对各利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的种离子的亲和力亲和力不同而达到分离目的不同而达到分离目的凝胶层析凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的组分的相对分子质量相对分子质量不同而达到物质分离不同而达到物质分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的专一而又可逆的亲和力亲和力，使生物分子分离纯化，使生物分子分离纯化层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的将酶等两性物质的等电点特性等电点特性与离子交换层析的特与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离性结合在一起，实现组分分离