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1、32 酶的提取与分离纯化280 2、沉淀分离、沉淀分离（根据溶解度的不同）提取（根据溶解度的不同）提取 特点特点:使溶液中的溶质由液相转变为固相析出使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 古老、实用、简单的初步分离方法古老、实用、简单的初步分离方法 生物大分子制备中常用沉淀方法：生物大分子制备中常用沉淀方法：1 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）2 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 3 选择性沉淀（热变性和酸碱变性）选择性沉淀（热变性和酸碱变性）4 等电点沉淀等电点沉淀 5 有机聚合物沉淀有机聚合物沉淀 2.1 1 盐析沉淀法盐析沉淀法（改变离子强度）（改变离子强度）基本原理基本原理（盐溶和盐析）（
2、盐溶和盐析）:向蛋白质或酶的水溶液中向蛋白质或酶的水溶液中 加入中性盐，可产生两种现象：加入中性盐，可产生两种现象：盐溶盐溶（salting insalting in）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。盐析盐析（salting outsalting out）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。蛋白质的盐析蛋白质的盐析 离子离子强强度度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响盐盐 析析盐溶盐溶 原因：原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合
3、外壳，降低溶解度而沉淀。除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。后析出，称分段盐析。盐析用盐盐析用盐 常用（常用（NHNH4 4）2 2 SOSO4 4，其突出优点：，其突出优点：a.a.溶解度大溶解度大 b.b.分离效果好分离效果好 c.c.不易引起变性不易引起变性 d.d.价格便宜价格便宜 盐浓度的表示盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示用饱和（溶解）度表示:溶液中饱和硫酸铵的体积溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度饱和
4、度 溶液的总体积溶液的总体积调整盐浓度的方式调整盐浓度的方式 饱和溶液法饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液.所需添加饱和硫酸铵溶液的体积：所需添加饱和硫酸铵溶液的体积：S2-S1 V=V0 1-S2 V,V0:分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度 添加固体硫酸铵添加固体硫酸铵适用于
5、：适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据按下式计算，得表中数据 B(S B(S2 2-S-S1 1)W=W=1-AS 1-AS2 2 A,B A,B常数，与温度有关。常数，与温度有关。实际使用时，可直接查表实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下需加固体硫酸铵的（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。量）。调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表盐析操作盐析操作盐析操作盐析操作l低饱和度：低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过一般终
6、饱和度不超过4040。l高饱和度：高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。积。注意注意:固体硫酸铵要研细，温和搅拌中缓慢加入。固体硫酸铵要研细，温和搅拌中缓慢加入。冰箱中冰箱中（4 4）过夜，待沉淀完全后高速离心。过夜，待沉淀完全后高速离心。沉淀再溶解后可用超滤沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltrationultrafiltration）、透、透 析析（dialysisdialysis）或层析或层析（chromatographychromatography）方法脱盐。方法脱盐。盐析曲线的制作盐析曲线的制作 如要分离一种新的蛋白质或酶，应先确定沉淀如要
7、分离一种新的蛋白质或酶，应先确定沉淀 该物质的硫酸铵饱和度。该物质的硫酸铵饱和度。蛋白质量蛋白质量(mg)(mg)或酶活力或酶活力 硫铵饱和度硫铵饱和度10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫酸铵浓度（硫酸铵浓度（%）枯草杆菌枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线淀粉酶发酵液的盐析曲线 盐析的影响因素盐析的影响因素离子强度和种类离子强度和种类（介绍盐析常数）（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：I I：离子强度，：离子强度，I=MZI=MZ2 2；M M：离子浓度：离子浓度（mol/Lmol/L）；Z Z：离子价数：离子价数S S：离
8、子强度为：离子强度为I I时的蛋白质的溶解度时的蛋白质的溶解度（g/Lg/L）S S0 0：离子强度为：离子强度为0 0时蛋白质的溶解度时蛋白质的溶解度（g/Lg/L）KsKs：盐析常数，是与：盐析常数，是与蛋白质蛋白质和和盐种类盐种类有关的特性常数。有关的特性常数。Ks Ks代表盐析效率代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，白质溶解度降低的速度，K Ks s越大盐析效果越好。越大盐析效果越好。当当温温度度一一定定时时，S S0 0对对于于某某一一溶溶质质是是常常数数，用用表示，盐析方程式可改写为：表示，盐析方程式可改写为：log S=
9、-K log S=-Ks s I I 两种盐析法：两种盐析法：K Ks s分级盐析法分级盐析法 ：在一定的：在一定的pHpH和温度条件下，利用不和温度条件下，利用不同蛋白质同蛋白质K Ks s的不同，通过改变离子强度或盐浓度的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改（即改变变I I值）值）的沉淀方法。的沉淀方法。分级盐析法分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变溶液：在一定离子强度下，通过改变溶液的的pHpH及温度的沉淀方法。及温度的沉淀方法。蛋白质浓度：蛋白质浓度：稀回收沉淀难，浓易共沉淀，稀回收沉淀难，浓易共沉淀，2.5%-3%最好。最好。pHpH值：等电点处最易沉淀。值：等电点处最易沉淀。温
10、度的影响：温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在在0044下操作下操作。2.2 2.2 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀（降低介电常数）（降低介电常数）利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。同而使之分离的方法。沉淀机理沉淀机理 降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水部分地引起蛋白质脱水 常用有机溶剂常用有机溶剂 丙酮丙酮
11、 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积的甲醇，用量一般为酶液体积的2 2倍左右，终浓度为倍左右，终浓度为70%70%。优缺点：优缺点：优点：分辨率比盐析法高优点：分辨率比盐析法高 沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐 溶剂易蒸发，沉淀易离心溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：容易引起蛋白质变性失活缺点：容易引起蛋白质变性失活 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。影响有机溶剂沉淀的因素影响有机溶剂沉淀的因素 温度温度 ：低温（：低温（0 0）操作。）操作。pH pH 值：尽可能靠近其等电点。值：尽可能靠近其等电点。离子强度：采用离子强度：采用 0.05mol/L0.05mol/L
12、的稀盐溶液的稀盐溶液,增加蛋白质在有机溶剂中的增加蛋白质在有机溶剂中的 溶解度溶解度,目的防止蛋白质变性目的防止蛋白质变性 蛋白质浓度：适当，一般为蛋白质浓度：适当，一般为5 520mg/ml20mg/ml 2.2.3 3 等电点沉淀等电点沉淀(isoelectric precipitation)(isoelectric precipitation)原理原理 蛋白质在等电点时溶解度最低蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点不同的蛋白质具有不同的等电点 使用方法使用方法 单单独独使使用用较较少少（用用于于从从粗粗酶酶液液中中除除去去某某些些等等电电点点相相距距较较大大的的杂杂蛋
13、蛋白白），多多与与其其它它方方法法联联合合使使用用（如如盐盐析析法法、有有机机溶剂法），溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。优点：优点：大多数蛋白质的大多数蛋白质的pIpI都在偏酸性范围内都在偏酸性范围内;无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低;无需除掉多余酸即可进行下一步纯化无需除掉多余酸即可进行下一步纯化.缺点缺点 酸化时，容易引起蛋白质失活酸化时，容易引起蛋白质失活 2.4 2.4 有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法 作用机理：作用机理：与有机溶剂类似与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。，是发展较快的一种
14、新方法。沉淀剂：沉淀剂：常用聚乙二醇常用聚乙二醇 （Polyethyene glycolPolyethyene glycol，简写，简写 PEG PEG）多用分子量为多用分子量为600060002000020000的的 PEG PEG。优点：优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性操作条件温和，不易引起生物大分子变性;沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEGPEG即可沉淀相当即可沉淀相当 多的生物大分子多的生物大分子;沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。2.5 2.5 选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质选择一定的条件使溶液中存
15、在的某些杂蛋白质变性沉淀变性沉淀而不影响所需蛋白而不影响所需蛋白质质的方法的方法。热变性热变性 所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。pH pH变性变性 等电点沉淀法是等电点沉淀法是pHpH变性法中的一种变体。变性法中的一种变体。有机溶剂变性有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。3 3、萃取、萃取（extractionextraction）分离分离 自学自学 利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的利用溶质在互不相溶的两
16、相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。特点：特点：比化学沉淀法分离程度高比化学沉淀法分离程度高;比离子交换法选择性好、传质快比离子交换法选择性好、传质快;比蒸馏法能耗低比蒸馏法能耗低.3.1 3.1 溶剂萃取法溶剂萃取法几个概念：几个概念：料液：供提取的溶液。料液：供提取的溶液。溶质：料液中欲提取的物质溶质：料液中欲提取的物质 。萃取剂：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂萃取剂：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂 。萃取液：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与萃取液：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与 萃取剂形成的溶液萃取剂形成的溶液 。萃余液：萃余
17、液：被萃取出溶被萃取出溶质质后的料液后的料液 。反萃取反萃取:（back extractionback extraction）：完成萃取操作后，：完成萃取操作后，将产物从有机相转入水相的萃取操作。将产物从有机相转入水相的萃取操作。溶剂萃取法是以分配定律溶剂萃取法是以分配定律（溶质的分配平衡规律（溶质的分配平衡规律 ）为为基础。基础。在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。为一常数。萃取相浓度萃取相浓度 C C1 1 分配系数分配系数 K K0 0=萃余相浓度
18、萃余相浓度 C C2 2 K K0 0值随溶液值随溶液pHpH的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的重要基础。重要基础。普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离,因为因为:蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂;蛋白质在有机相中易变性失活蛋白质在有机相中易变性失活;故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物 物质的提取。物质的提取。萃取操作的萃取操作的3个步骤：个步骤：混合混合;分离分离;溶剂回收溶剂回收.单级萃取单级萃取:使用一个混合器和一个分离器使用一个混合器和一个
19、分离器 3.2 3.2 双水相萃取技术双水相萃取技术（partion of two aqueous phase partion of two aqueous phase systemsystem）又称水溶液两相分配技术又称水溶液两相分配技术 用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇如聚乙二醇（PEGPEG）和葡聚糖和葡聚糖（DextranDextran）进行萃取。由进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量于形成的两相均有很高的含水量（达（达70%70%90%90%），），故故称称“双水相双水相”系统。系统。优点：优点：l每一水相中均有很高的含水
20、量，为酶等生每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；物物质提供了一个良好的环境；lPEGPEG、DextranDextran和无机盐对酶等无毒害作用，和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。不会引起变性。双水相的形成：双水相的形成：两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。体系。a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点PEG/DxPEG/Dx和和PEG/KPiPEG/KPi系统的典型相图系统的典型相图 几种典型的双水相系统几种典型的双
21、水相系统聚丙二醇聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇聚乙二醇、聚乙烯醇 葡聚糖葡聚糖（DexDex）、羟丙基葡聚糖、羟丙基葡聚糖聚乙二醇聚乙二醇（PEGPEG）葡聚糖葡聚糖（DexDex）硫酸葡聚糖钠盐硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素甲基纤维素聚乙二醇聚乙二醇（PEGPEG）磷酸钾、硫酸铵磷酸钾、硫酸铵 硫酸钠、硫酸镁硫酸钠、硫酸镁萃取原理：萃取原理：利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。应用应用 胞内酶的提取和精制胞内酶的提取和精制:除去细胞碎片，并使酶得到纯化。除去细胞碎片，并使酶得到纯化。几种典型的
22、双水相萃取酶蛋白实例几种典型的双水相萃取酶蛋白实例 酶酶 菌菌 种种 相系统相系统 延胡索酸酶延胡索酸酶 Brevibacterium spBrevibacterium sp.PEG/PEG/盐盐 天冬氨酸酶天冬氨酸酶 E.coliE.coli PEG/PEG/盐盐 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 E.coliE.coli PEG/PEG/盐盐 亮氨酸脱氢酶亮氨酸脱氢酶 Bacillus spBacillus sp.PEG/Dex.PEG/Dex 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶 Bakers yeast PEG/Bakers yeast PEG/盐盐 青霉素酰化酶青霉素酰化酶 E.coliE.coli PEG/
23、PEG/盐盐 双水相萃取法的重要研究方向双水相萃取法的重要研究方向 -亲和萃取亲和萃取（亲亲和分配和分配 ）使用具有生物特异性的配基使用具有生物特异性的配基（ligandligand）来提来提高分离选择性。高分离选择性。蛋白质蛋白质配基配基胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶三嗪染料三嗪染料甲酸脱氢酶甲酸脱氢酶三嗪染料三嗪染料葡糖葡糖-6-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶三嗪染料三嗪染料亲和萃取酶实例亲和萃取酶实例3.3 3.3 超临界流体萃取超临界流体萃取 兼有蒸馏和溶液萃取的特征，兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常与常规规溶溶剂剂萃取的区萃取的区别别：将超临界流体作为萃
24、取剂。：将超临界流体作为萃取剂。超临界流体超临界流体(supercritical fluid(supercritical fluid，SCFSCF）：超过：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点的点临界点后的流体临界点后的流体。临界点的概念可用临界温度和临界压力解释：临界点的概念可用临界温度和临界压力解释：临界温度：高于此温度时，无论加压多大也不临界温度：高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化。能使气体液化。临界压力：在临界温度下，液化气体所需要的临界压力：在临界温度下，液化气体所需要的压力。压力。SCFSCF性质介于液体和气体之间性质介于
25、液体和气体之间 ：SCF SCF密度接近于液体，溶解度高。密度接近于液体，溶解度高。SCF SCF粘度和扩散系数接近于气体粘度和扩散系数接近于气体,传质扩散快传质扩散快。基本过程：基本过程：在在SCFSCF中，溶解度大的物质溶于其中，与不中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。溶解或溶解度小的物质分开。降低压力，使降低压力，使SCFSCF变为气态（密度降低），变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。常用超临界液态常用超临界液态COCO2 2作为萃取剂，因为：作为萃取剂，因为：液体液体COCO2 2无毒无毒 临界温度临界温度
26、（304.06K304.06K）接近常温接近常温 临界压力临界压力（7.38MPa7.38MPa）较低较低 操作安全操作安全超临界超临界COCO2 2萃取技术在生物、食品等工业中的应用萃取技术在生物、食品等工业中的应用 CO CO2 2萃取部分产品萃取部分产品 原料名称原料名称 产物名称产物名称 原料名称原料名称 产物名称产物名称 小麦胚芽小麦胚芽 胚芽油胚芽油 豆子豆子 豆油精炼油豆油精炼油 啤酒花啤酒花 啤酒花精油啤酒花精油 茉莉花茉莉花 净油净油 辣椒辣椒 辣椒红色素辣椒红色素 菊花根菊花根 除虫菊酯除虫菊酯 当归当归 精油精油 紫草紫草 紫草宁紫草宁 银杏叶银杏叶 银杏内酯银杏内酯 花
27、生花生 精炼油精炼油 3.4 3.4 反胶团萃取反胶团萃取 反胶团：又称反胶束反胶团：又称反胶束（Reversed MicellesReversed Micelles）指表面活性剂指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体定的纳米级的聚集体。反胶团模型反胶团模型亲水基团向内聚集亲水基团向内聚集（正）胶束（正）胶束反胶束反胶束形成形成 表面活性剂溶于水，表面活性剂溶于水，使其浓度超过临界使其浓度超过临界胶束浓度。胶束浓度。表面活性剂溶于非极表
28、面活性剂溶于非极性溶剂，使其浓度超性溶剂，使其浓度超过临界胶束浓度。过临界胶束浓度。构造构造 表面活性剂极性基表面活性剂极性基团在外，非极性基团在外，非极性基团在内，形成非极团在内，形成非极性核心。性核心。表面活性剂非极性基表面活性剂非极性基团在外，极性基团在团在外，极性基团在内，形成极性核心，内，形成极性核心，溶于水后，形成水池溶于水后，形成水池（water pool water pool）。）。功能功能 溶解非极性物质溶解非极性物质溶解极性物质溶解极性物质vp154萃取过程萃取过程第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二
29、种水相中，第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，实现对蛋白质的反萃取过程。实现对蛋白质的反萃取过程。反胶团萃取原理反胶团萃取原理 表面活性剂及有机溶剂表面活性剂及有机溶剂 反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。剂中加入了少量表面活性剂。表面活性剂常用：表面活性剂常用：AOT AOT(Aerosol OT)(Aerosol OT)（阴离子表面活性剂，琥（阴离子表面活性剂，琥珀酸珀酸2-2-乙基己基酯磺酸钠）。乙基己基酯磺酸钠）。特点：特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的反易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。非极性有机溶剂非极性有机溶剂:环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。己醇、硅油。