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1、远离宫颈癌，做健康快乐女性警醒！警醒！目前，世界上每2分钟就有一位妇女死于宫颈癌，宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。其中，发展中国家的死亡率大约占80%。宫颈癌n病因：病因：宫颈癌是目前唯一一个病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒（宫颈癌是目前唯一一个病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒（Human Human papillomaviruses,HPV)papillomaviruses,HPV)的持续感染相关。的持续感染相关。n引起宫颈癌的高危因素：引起宫颈癌的高危因素：性行为：过早，过频，多个性伴侣月经及分娩因素：经期卫生不良，经期延长，早婚，早育，多产等
2、性传播疾病导致的宫颈炎症对宫颈的长期刺激；吸烟：摄入尼古丁降低机体的免疫力，影响对HPV感染的清除，导致宫颈癌特别是鳞癌的风险增加；长期服用口服避孕药：服用口服避孕药8年以上宫颈癌特别是腺癌的风险增加两倍 免疫缺陷与抑制：HIV感染导致免疫缺陷和器官移植术后长期服用免疫抑制药物导致宫颈癌的发生率升高 其它病毒感染：疱疹病毒II型（HSV-II）与宫颈癌病因的联系不能排除。n病理病理：宫颈癌中最常见的是鳞状上皮细胞癌，20世纪90年代宫颈鳞癌占75%，而腺癌约占25%宫颈鳞状细胞癌的好发部位为 宫颈阴道部鳞状上皮与宫颈管 柱状上皮交界处（鳞-柱交界）。在正常生理情况下，鳞-柱交界随体内雌激素水平
3、变化而上下移动。鳞-柱上下移动的区域称为移动带，在移动带形成过程中，其表面被覆盖的柱状上皮被鳞状上皮所代替，而在此时如有某些外来致癌因素刺激，或多次妊娠导致宫颈鳞-柱交界反复移动，以及宫颈伤，炎症时，移动带区活跃的未成熟细胞或增生的鳞状上皮可向非典型方向发展成为宫颈上皮内瘤样病变，并继续发展成为镜下早期浸润癌和浸润癌。宫颈癌的演变过程宫颈上皮内瘤变（CIN）：是一组病变的统称，包括宫颈不典型增生和原位癌，为宫颈浸润癌的癌前期病变。通常将CIN分为3级，以轻，中，重级不典型增生来区分宫颈浸润癌正常宫颈轻度不典型增生(或称级)：细胞异型性轻，异常增生的细胞仅限于上皮层的下1/3，中、表层细胞正常。
4、中度不典型增生(或称级)：细胞异型性明显，异常增生的细胞限于上皮层的下2/3未累及表层。重度不典型增生(或称级)：细胞异型性显著异常增生的细胞占据上皮内2/3以上或达全层。宫颈癌的治愈率 只要能及早发现，通过手术、放疗，辅以化疗的规范化综合治疗，宫颈癌的治愈率很高。大量研究和临床实践证明，宫颈原位癌的治愈率接近100，宫颈癌I期的治愈率可达80至90，II期可达60至70，III期可达40至50，而IV期仅为10。宫颈癌的诊断方法n“三阶梯”诊断步骤 即细胞学阴道镜检组织学检查（Cytology-Colposcopy-Histology，CCH）n细胞，组织病理学检测：VIA（Visual i
5、nspection with acetic acid）醋酸目测法 一种用于廉价、使用简单、“低技术含量”的肉眼筛查方法，有癌前病变的区域在醋酸的作用下会变成白色。缺点：技术灵敏度及特异性较低。巴氏涂片 采取阴道及宫颈脱落细胞制成涂片，经染色可观察细胞的变异。缺点：巴氏涂片的准确性受许多因素的影响如：医生读片水平、涂片取材、制作、染色技巧等，不可避免地会导致假阴性的出现 TCT（Thinprep Ctytologic test）薄层细胞学检测系统 用特制小毛刷将宫颈管内及宫颈外口的细胞刷洗在放有细胞保存液的小瓶中，经过滤、分离后制成薄层细胞载玻片，经巴氏染色、封片，由细胞学专家肉眼在显微镜下阅片
6、，按法作出诊断报告。该设备一次只能处理一份标本。相对传统巴氏涂片，这种技术对异常细胞诊断率和检出率均有提高，但只是制片技术的改进，没有阅片方式上的改变，假阴性问题没有得到根本解决。CCT 计算机辅助细胞检测系统，也称为细胞电脑扫描 该技术运用人工智能高新技术，对宫颈异常细胞具有高度敏感性，擅长发现各种异常细胞，包括传统法易于漏诊的异常细胞，体积小的异常细胞及细胞分布少的涂片上少量的异常细胞n病原性检测：以上技术都是只能筛查出以发生病变的宫颈，为了真正的做到防范于未然，宫颈HPV-DNA检测法应运而生。宫颈癌与HPV世界范围研究表明HPV可以在99.8的宫颈癌患者中发现HPV的感染使宫颈癌的相对
7、危险性增加250倍1995年，国际癌症研究机构(IARC)专题讨论会通过HPV感染是宫颈癌的主要原因，即HPV感染是宫颈癌发生的必要条件2005年，IARC/WHO推荐HPV检测可以用于宫颈癌筛查。HPV病毒nHPV（Human papillomavirus,HPV)人乳头状瘤病毒，属于乳头瘤病毒科nHPV 是一种双链DNA病毒，具有嗜上皮性，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，病毒的种间不存在交叉感染;n其基因组长度约为8000bp，主要由早期基因区(E区)、晚期基因区(L区)和长控制区(long control region,LCR)组成;nHPV是一组病毒的总称，到目前为止，已鉴定出1
8、00种以上HPV亚型。不同的亚型可以导致不同的疾病。HPV 三维结构模型8000bp200040006000E6E7E1E2E4E5L1L2LCRE6E6E6E6E6E6E6E6E6E6E7E7E7E7E7E7E7E7E7E7E6/E7癌原蛋白诱导人体细胞转化与P53结合，加速P53降解，使P53的正常功能消失与pRB结合，打断pRB与一种细胞进入S期必须的转录因子E2F-1的结合DNA结构蛋白，可抑制E6、E7基因的转录编码组成病毒衣壳的结构蛋白与宿主DNA结合时的开环分子与宿主DNA结合时的缺失区E2基因表达的缺失，使E6、E7基因表达增加。E6、E7产物与P53和pRB结合干扰细胞正常功
9、能，使宿主细胞积累越来越多的DNA损伤和突变，最终导致细胞癌变。E6E7HPV 基因型HPV癌基因E6,E7,和L1 ORF 的核酸序列与已知基因型的核酸序列同源性小于90%则认为是一个新的基因型。根据HPV的致癌危险性的大小，可把HPV分为低危型低危型和高危型高危型两大类。以HPV感染为主要病因在各种癌症中所占的比例HPV 感染例数感染例数总病总病例数例数宫颈宫颈肛门肛门外阴外阴阴茎阴茎每年病例数每年病例数0100,000200,000300,000400,000500,00099.8%60%95%35%50%口咽口咽HPV与宫颈癌HPV感染特点疾病疾病HPVHPV基因型基因型扁平疣3、10
10、、27、28、41寻常疣1、2、4、7、27、29、40、54疣状表皮发育不良5、8、12、14、15、17、19、25、38、46、47、49、50尖锐湿疣尖锐湿疣6 6、1111、1616、1818、3131、3333、3434、3535、3939、5151、6468 6468、7070、7373 鲍温样丘疹病16、18、39、42宫颈上皮内瘤6、11、16、18、31、33、35、43、44、51、56、58、61浸润性宫颈癌浸润性宫颈癌1616、1818、3131、3333、35 35、3939、4545、5151、5252、5656、5858、5959、6868阴茎癌16、18女阴癌
11、16、18HPV感染途径n性接触传播丈夫阴茎性接触传播丈夫阴茎HPVHPV的存在可使妻子的存在可使妻子宫颈受染的危险增加宫颈受染的危险增加9 9倍，相同的倍，相同的HPVHPV亚型亚型可以在性伴侣中检出，与此相反，处女通可以在性伴侣中检出，与此相反，处女通常是检测不到常是检测不到HPVHPV感染感染n表皮接触传染是主要传播方式，因此带安表皮接触传染是主要传播方式，因此带安全套难以预防全套难以预防n母婴传播母亲生殖道的母婴传播母亲生殖道的HPVHPV感染也可以传感染也可以传播至她们的婴儿的口腔中播至她们的婴儿的口腔中HPV感染潜伏期 低危型低危型HPVHPV感染平均持续时间是感染平均持续时间是4
12、.84.8个月，高危型个月，高危型HPVHPV感染平均持续时间大概是感染平均持续时间大概是8 8个月。个月。HPVHPV感染的最感染的最常见的结局是没有明显的临床表现，绝大部分会常见的结局是没有明显的临床表现，绝大部分会被机体免疫力自动清除。被机体免疫力自动清除。Richardson,et al.2003 Richardson,et al.2003HPV感染与发病的时间 只有持续的高危型的HPV感染才会发生CIN或CC。一般平均8-24月可发生CIN1、CIN2和CIN3，再平均8-12年可发生浸润癌。我国宫颈癌筛查现状n近年来，我国宫颈癌发病率正以每年3-5%的速度增长，每年约有8万人死于宫
13、颈癌，病死率是法国国家的10倍。究其原因，是我国宫颈癌筛查率太低。n我国25岁以上的妇女，有超过70%的人从未做过宫颈癌筛查。n专家呼吁，任何有3年以上性行为或21岁以上有性行为的妇女，起码每3年做1次宫颈癌筛查HPV感染、癌前病变及宫颈癌 1.HPV1.HPV感染的高发病率时期在女性开始性活动的性活跃期，随后感染率下降；因为大部分的感染的高发病率时期在女性开始性活动的性活跃期，随后感染率下降；因为大部分的HPVHPV感染是自限性的。感染是自限性的。2.2.癌前病变的发病高峰在癌前病变的发病高峰在HPVHPV感染高峰的若干年之后，并且大大低于感染高峰的若干年之后，并且大大低于HPVHPV的感染
14、率；只有一部分感染的感染率；只有一部分感染HPVHPV的女性发生癌前病变。的女性发生癌前病变。3.3.宫颈癌的发生又在癌前病变的若干年之后，出现癌前病变与宫颈癌发病之间有较长的时间间隔。宫颈癌的发生又在癌前病变的若干年之后，出现癌前病变与宫颈癌发病之间有较长的时间间隔。HPV现患率与宫颈癌发病率变化图n高危HPV检测捕获早期宫颈癌，这是近年来医学界公认的一种快速，有效的检测方法，可使宫颈癌的检出率达99%以上。n据报道，美国每年有CINI的新患者约100万，CINII或III期的新患者约50万，英格兰报道每年有2万多CINIII，这应该归功于宫颈癌早期筛查的实施。n2005年，世界卫生组织表示
15、，HPV DNA检测可以作为宫颈癌的初筛手段，目前我们也是采用这种方法筛查宫颈癌。HPV DNA筛查技术nHPV DNA 筛查技术与细胞学检测的方法相比，用于检测宫颈癌前病变更敏感、更可靠。n与细胞学检测法相比，HPV DNA检测能降低4-5年内的宫颈癌发生率和8年内的宫颈癌致死率nHPV DNA检测阴性比宫颈涂片检查阴性更具有保障性目前使用于HPV DNA 检测的技术核酸检测杂交法荧光PCRE6/E7 mRNA 表达、P16 INK4a/Ki-67 双重测试 杂交捕获法 Qiagen（HCII）传统杂交法 达安（19种HPV分性）亚能（对外宣称23种，SFDA只给予15种HPV分型）导流杂交
16、法 凯普（21和37种HPV分型）不分型产品：凯普（13高危）港龙（13高危）达安（8高危）罗氏（13高危）分型产品：凯普（12+2，能准确检测出16、18 HPV亚型)罗氏（12+2，检测16、18HPV亚型）意大利AB公司（8亚型，不具体分型只能将病毒分成3大类）目前尚无产品，仍处于科研阶段杂交捕获法（HCII）检测13种高危型或5种低危型，但不分型不分型。有时探针之间存在交叉反应交叉反应，反应灵敏度较低灵敏度较低，不能显示不能显示是否是多重感染多重感染。高危型和低危型分开检测分开检测，由两次检测完成，增加测试成本。一种非放射性的分子杂交化学发光信号放大系统，它结合了抗体捕获和化学发光信号
17、检测技术。信号倍增系统：样品HPV DNA双链被释放并分解为可杂交的核苷酸后，单链标记的固相化的RNA探针与目标HPV DNA杂交 DNA：RNA的杂交信号在固相载体上转化为免疫结合 由标记碱性磷酸酶的抗体介导产生化学发光信号，信号通过化学发光放大，仪器读取结果 传统杂交法探针PCR扩增产物化学信号杂交4-6小时，清洗、封阻2-4个小时后显色生物素杂交发生在膜表面，显色时单位面积内能产生信号的分子较少，达到同样强度的信号，耗时更长 需要大量目的样品和试剂去覆盖杂交膜，浪费浪费了大量试剂和目的样品。目的分子大多只能在杂交膜表面反应，随着慢慢渗透扩散进入后才能在膜内部反应，反应速度很慢反应速度很慢
18、。很难清洗残留于杂交膜孔径中的非特异性结合，导致背景高背景高，敏感度降低敏感度降低。导流杂交法探针PCR扩增产物生物素 主动将目标分子导向固定在基因芯片上特别主动将目标分子导向固定在基因芯片上特别设计的探针，跟捕捉到的分子进行杂交而产设计的探针，跟捕捉到的分子进行杂交而产生复合物，同时不受限制的的分子则穿过芯生复合物，同时不受限制的的分子则穿过芯片被清除。导流杂交法提高了分子之间的相片被清除。导流杂交法提高了分子之间的相互作用，将传统杂交法的二维平面作用提升互作用，将传统杂交法的二维平面作用提升至三维空间的相互作用，提升了至三维空间的相互作用，提升了DNA分析的分析的特异性，达到临床快速检测的
19、要求。特异性，达到临床快速检测的要求。吸力吸力杂交15分钟，清洗，封阻5-10分钟后显色探针样本单链DNA生物素AV-AP链亲和素-AP酶聚合物颜色底物化学信号HPV16多重感染：HPV16、33、53、66HPV阴性结果 只需少量少量目的样品和试剂，可提供较高浓度的目的样品 用于杂交。通过外力使目的分子主动导流穿过杂交膜，反应速度快反应速度快。通过外力引导清洗液穿过杂交膜孔径，背景干净背景干净，杂交 清洗时间短清洗时间短凯普公司导流杂交仪杂交仪CE认证两项美国专利专利号:5741647 和6020187 性价比高；节约试剂；操作工序简单，当今最快、最洁净的杂交系统；降低操作中的误差 一张膜对
20、应一个反应格，一次性可完成15人或30人份的检测，反应时不会与其他格样本发生交叉污染凯普公司HPV基因分型检测试剂盒组成nPCR扩增试剂盒（-20保存）PCR premix、Taq聚合酶、阳性对照、阴性对照n杂交试剂盒（4保存）杂交液、溶液A、溶液B、溶液C、封阻液、酶标液、NBT/BCIP药片、杂交膜 n试剂盒有效期：6个月 宫颈细胞取样保存系统宫颈细胞取样保存系统PCR扩增试剂盒扩增试剂盒DNA提取试剂盒提取试剂盒杂交试剂盒杂交试剂盒凯普HPV基因分型试剂盒的相关证书HPV基因分型的主要步骤样本采集样本采集DNA提取提取PCR扩增扩增杂交反应杂交反应显示结果显示结果出报告出报告 步骤一步骤
21、一 由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。然后使用专用的然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口采集采样刷置于宫颈口采集标本。（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分标本。（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）泌物）步骤二步骤二 将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈 刷使其顺时针旋转刷使其顺时针旋转5圈圈。步骤三步骤三 慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。样本一经
22、采集，则应尽可能快的送至检测样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。如若不能马上送检样本，请于实验室。如若不能马上送检样本，请于4保存，并在保存，并在2个星期之内进行检测。个星期之内进行检测。HPV基因分型的主要步骤样本采集样本采集DNA提取提取PCR扩增扩增杂交反应杂交反应显示结果显示结果出报告出报告取取500l500l混匀的临床样本，加入混匀的临床样本，加入1.5 ml1.5 ml离心管，离心管，14000rpm14000rpm离心离心5 5分钟，去上清分钟，去上清加加400l400l溶液溶液I I，100 15100 15分钟分钟加入加入400l400l溶液溶液，混匀，放置，混匀，放
23、置2 2分钟分钟14000rpm14000rpm离心离心5 5分钟，去上清分钟，去上清14000rpm14000rpm离心离心1 1分钟，再次去上清分钟，再次去上清加入加入60l60l溶液溶液充分溶解，充分溶解，-20-20保存保存在煮沸样品时,切记不要让沸水溅入到样品管中!以免污染样本。建议水沸腾后调低火力.临床样本中血太多 取细胞前在振荡器上振荡时间长些 离心收集细胞后，再用细胞保存液多洗几次 临床样本中黏液太多 取细胞前在振荡器上振荡时间长些 或取出细胞保存液中的刷头，吸取瓶底部液 建议医生在取样时尽量规范 HPV基因分型的主要步骤样本采集样本采集DNA提取提取PCR扩增扩增杂交反应杂交
24、反应显示结果显示结果出报告出报告我们做我们做4040个循环个循环吸取样本DNA做PCR时，尽量不要吸到离心管底部的沉淀HPV基因分型的主要步骤样本采集样本采集DNA提取提取PCR扩增扩增杂交反应杂交反应显示结果显示结果出报告出报告导导流流流流杂杂交原理交原理交原理交原理vv将将将将特异性的特异性的特异性的特异性的DNADNA探探探探针针固定于低密度基因芯片固定于低密度基因芯片固定于低密度基因芯片固定于低密度基因芯片杂杂交膜上交膜上交膜上交膜上vv带带有生物素有生物素有生物素有生物素标记标记的的的的样样本本本本单链单链DNADNA导导流穿流穿流穿流穿过杂过杂交膜，与薄膜交膜，与薄膜交膜，与薄膜交
25、膜，与薄膜上探上探上探上探针针结结合合合合vv把把把把APAP酶酶加到加到加到加到结结合物上，合物上，合物上，合物上，APAP酶酶会与生物素会与生物素会与生物素会与生物素结结合合合合vv加入底物溶液，加入底物溶液，加入底物溶液，加入底物溶液，APAP酶酶便能催化便能催化便能催化便能催化颜颜色物的形成，从而色物的形成，从而色物的形成，从而色物的形成，从而显显示示示示杂杂交的交的交的交的产产生生生生vv杂杂交交交交仪仪的的的的导导流和控温装置使得流和控温装置使得流和控温装置使得流和控温装置使得杂杂交交交交过过程更高效和便利程更高效和便利程更高效和便利程更高效和便利探针样本单链DNA生物素AV-AP
26、链亲和素-AP酶聚合物颜色底物HPV基因分型的主要步骤样本采集样本采集DNA提取提取PCR扩增扩增杂交反应杂交反应显示结果显示结果出报告出报告一次可同时得到单一感染或多重感染的丰富信息在一张基因芯片上同时完成对杂交和扩增过程的全面监控独特的导流杂交原理使得操作更便捷，节约时间在一张基因芯片上可检出15种高危型和6种低危型分型分型检测省省时省力省力双重双重对照照信息信息丰富丰富杂交膜探针分布示意图杂交膜探针分布示意图 单重感染单重感染 多重感染多重感染HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16HPV33HPV33HPV53HPV53HPV53HPV53HPV66HPV66生物素
27、点生物素点：主要监控所采用的杂交体系是否有效ICIC点：点：排除由于PCR抑制导致的假阴性实验结果 对于阴性样本，只有生物素点和IC点同时显色才是 正常结果 如果阳性点显色，但IC点不显色，结果是正常21种人乳头瘤病毒（HPV）分型检测试剂盒11 技术原理技术原理PCR低密度基因芯片导流杂交技术 资质资质2006年获SFDA认证、CE认证 2007 年获得中国发明专利，专利号 ZL 2007 1 0030723.62008年被广东省认定为高新技术产品 产品特点产品特点能一次检测出21种HPV型别：HPV-6，HPV-11，HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-35，H
28、PV-39，HPV-42-45，HPV-51，HPV-53，HPV-56，HPV-58，HPV-59，HPV-66，HPV-68和HPV-81(cp8304)。其中包括3种中国人常见型别(下划线标记)。具有高通量、灵敏和快速等特点，全程操作只需3-4个小时，临床评价灵敏度和特异性均在95%以上。21分型及同类产品比较产品技术特点比较凯普凯普21分型分型分型检测分型检测导流杂交导流杂交罗氏罗氏37分型分型PCR&杂交杂交HPV52特异性较差特异性较差HC-2杂交捕获杂交捕获不能分型不能分型上海之江上海之江荧光分型检测荧光分型检测8个反应管，操作复杂个反应管，操作复杂北京金菩嘉北京金菩嘉表面等离子
29、谐表面等离子谐振振两次两次PCR，两次提取，两次提取，操作复杂操作复杂达安基因达安基因19分型分型分型检测分型检测传统杂交，操作复杂传统杂交，操作复杂深圳亚能深圳亚能23分型分型港龙生物港龙生物26分型分型21分型学术影响力论文论文科研项目科研项目HPVHPV数据库数据库卫生部临检中心卫生部临检中心HPVHPV检测行业室间评估检测行业室间评估WHO HPVWHO HPV网络监测评估网络监测评估国内外核心期刊上发表文章超过150篇，其中SCI收录国际论文15篇。参与国家863（北京大学附属第一人民医院）和973项目（华中科技大学附属同济医院）以及省市各级地方项目研究20余项。同卫生部合作，凯普公
30、司主导，北大附属第一人民医院、武汉同济医院、复旦大学附属妇产科医院及广东省妇幼联合参与。中国临检中心之前一般只对HPV16和18两种型别进行测试。随着凯普21基因分型的推广，促使了中国临检中心从2012年5月开始对临床机构进行包含HPV16和18之内的多个HPV型别的检测评估。2010,2011连续两年参与WHO HPV网络试验评估，国际上使用凯普21基因分型检测产品的实验室（伊朗、马来西亚、中国上海，中国广东潮州）检测结果同WHO提供的标准品检测100%符合。学术影响力-凯普21分型检测产品优于罗氏LA21分型检测的意义及临床应用v预测受受检者者发病的病的风险度，确定最佳的治度，确定最佳的治
31、疗时期期v区分持区分持续（重复）感染与一（重复）感染与一过性感染性感染v区分区分单一感染和多重感染一感染和多重感染v针对不同型不同型别的感染采取不同的的感染采取不同的处理方案理方案检测意义v筛查v阴道阴道镜适适应症症v宫颈病病变随随访v指指导疫苗的使用疫苗的使用临床应用荧光PCR原理 在PCR反应体系中有上下游引物，在 荧光PCR体系中也有上下游引物，还 加入了一个荧光基团-探针 在PCR扩增过程中,特异性引物和探针 分别与靶序列结合，由于此时荧光基 团与猝灭基团离的很近，猝灭基团对 荧光基团的发光起到了抑制作用，因 此荧光基团不发光。Taq酶在引物的引导下复制靶序列；当遇到结合在两条引物之间
32、的探针 时，发挥5端外切酶功能，将探针 水解，水解下来的FAM荧光基团受激 发发射荧光，每合成一条DNA链发射 一次荧光信号。当靶序列呈指数增长时，发射的荧光 信号量相应增长，因此只要标本中含 相应型别的HPV病毒就会有荧光信号的 积累，从而达到检测HPV DNA的目的。荧光猝灭荧光定量PCR技术：n每一个循环的产物进行定量分析n所谓real-time Q-PCR技术，是 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。实时荧光实时荧光PCR荧光曲线图荧光曲线图指数扩增期非指数扩增期扩增产物荧光曲线背景期13种高危型人乳头状瘤病毒核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒11
33、技术原理技术原理荧光PCR技术平台 资质资质2007年获SFDA认证、CE认证。2009 年获得中国发明专利，专利号 ZL 2009 1 0037452.6。产品特点产品特点一次检测出13种高危HPV型别：HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-59 和HPV-68。灵敏度、特异性高于95%，精密度高（CV值小于5%）在全封闭体系中完成扩增与检测，有效控制污染操作简便，自动化操作，完成整个过程只需要2-3个小时。13种高危及同类产品比较产品特点凯普凯普13高危高危包含了包含
34、了WHOWHO和和FDAFDA所要求的所要求的1212种种高危型别高危型别HC-2 13高危高危 灵敏度、操作简易性和性价比低于灵敏度、操作简易性和性价比低于凯普凯普1313高危高危达安基因达安基因8个个高危高危不能够满足不能够满足WHOWHO对对HPVHPV检测所要检测所要求的最低标准求的最低标准深圳匹基深圳匹基2个个高危高危美国 FDA 指出：HPV检测产品至少要能检测出HPV检测指南所列特异性高危HPV类型中的12种 13高危HPV荧光检测联合21HPV分型试剂盒的筛查方案 1313高危高危HPVHPV荧光检测试剂盒在临床应用上，主要的作用在于能对大规模荧光检测试剂盒在临床应用上，主要的
35、作用在于能对大规模人群进行宫颈癌初筛。具体实施办法如下：人群进行宫颈癌初筛。具体实施办法如下：普通人群普通人群90%正常未感染正常未感染10%10%左右阳性高危人群左右阳性高危人群筛查，筛查，1 1次次3-53-5年年用13高危HPV荧光检测进行初筛用21HPV 分型试剂盒HPV16HPV16、1818感染感染其他型别感染其他型别感染阴道镜阴道镜/组织学检查组织学检查液基细胞学检查液基细胞学检查异常异常正常正常筛查，筛查，1 1次次6 6个月个月-1-1年年14种高危型人乳头状瘤病毒联合16/18基因分型检测（12+2）试剂盒产品特点产品特点四通道荧光PCR检测，一次检测出14种高危HPV型别
36、：HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-59,HPV-66和HPV-68，同时能对HPV16和HPV18进行分型检测。具有-globin基因内对照，可以监测所检测样本的可靠性。操作简便，自动化操作，完成整个过程只需要2-3个小时。检测区域设计在HPV基因组E区，避免造成漏诊。HPV16+18=70%-80%宫宫颈癌颈癌，可见在HPV荧光分型的产品中，对HPV16、18分型的重要性14种高危型人乳头状瘤病毒联合16/18基因分型检测（12+2）试剂盒11荧光PCR技术平台。可在同一反应管中通过仪器四种
37、荧光检测通道分别检测第一组不分型12种高危型HPV、第二组高危型HPV 16、第三组高危型HPV 18及第四组细胞内-globin基因。第四组同步检测细胞内保守基因-globin，用于评估采集样本质量及PCR抑制因素，对检测过程进行质量控制。2010年通过CE认证。2011年4月申请中国发明专利（申请号20110087008.2），二审已经通过。2012年2月完成了临床试验验证，11月底通过了SFDA注册评审。技术原理技术原理 资质资质凯普凯普12+212+2罗氏罗氏12+212+2匹基匹基6 6和和11/1611/16、1818HOLOGIC HOLOGIC Cervista Cervist
38、a 1414高危高危 WHO WHO 标准标准符合符合符合符合不符合不符合符合符合分型分型直接分型直接分型直接分型直接分型同时检测同时检测6 6、1111分型检分型检测测1616、1818不能直接分不能直接分型，如要分型，如要分型需另一种型需另一种试剂盒试剂盒实验操作实验操作简单简单简单简单分分3 3次检测次检测分分2 2次检测次检测检测区域检测区域E E区区L1L1区，整合区，整合时片段容易时片段容易丢失，造成丢失，造成假阴性假阴性L L区区E E区和区和L L区区凯普公司12+2高危HPV荧光检测与同类产品的比较14种高危（12+2）检测的临床应用n可以独立应用于临床检测和普通人群宫颈癌的
39、筛查。n该产品检测仪器设备要求较高，需要起码4个通道的荧光PCR仪，更适合于在国内经济发达地区及国际市场推广。n特别适应美国阴道镜与宫颈协会（ASCCP)2009年推荐的宫颈癌筛查方案。即HPV16或者18型别感染的患者，则直接行阴道镜下组织活检，无需再经过细胞学检测（巴氏涂片或TCT）。这样既能避免HPV16、18型的宫颈病变患者漏诊，又可以节约大量的医疗资源。12+2HPV 荧光试剂盒的筛查方案普通人群普通人群90%正常未感染正常未感染筛查，筛查，1 1次次3-53-5年年用12+2 HPV荧光检测进行初筛HPV16HPV16、1818感染感染其他型别感染其他型别感染阴道镜阴道镜/组织学检
40、查组织学检查液基细胞学检查液基细胞学检查异常异常正常正常筛查，筛查，1 1次次6 6个月个月-1-1年年荧光试剂盒的使用方法（适用于13高危和12+2）（1）实验室操作步骤（一步裂解法）：取取0.51ml振荡混匀的临床样本，振荡混匀的临床样本，加入加入1.5ml离心管离心管13000rpm离心离心5分钟分钟0.5ml细胞保存液，重悬细胞，细胞保存液，重悬细胞，13000rpm离心离心5分钟分钟50ul细胞裂解液，重悬细胞细胞裂解液，重悬细胞100，15分钟分钟13000rpm离心离心10分钟，上清分钟，上清DNA备用备用弃上清（用小枪头吸，尽量去除干净弃上清（用小枪头吸，尽量去除干净）荧光PC
41、R的操作步骤PCR试剂解冻试剂解冻在洁净离心管中按比例混合在洁净离心管中按比例混合PCRmix、Taq酶，混匀，短暂离心。酶，混匀，短暂离心。18l/管管 分装到分装到PCR管管将临床样本将临床样本DNA及阴阳对照（及阴阳对照（2l）加入到各加入到各PCR管管标记各管，混匀，短暂离心标记各管，混匀，短暂离心各管放入各管放入PCR仪，按程序扩增仪，按程序扩增结果分析结果分析荧光试剂盒的使用方法（适用于13高危和12+2）（2）n 对照：试剂盒中的阴阳性对照不需处理，短暂离心后取2ul 加入阴阳性PCR 管即可。n PCR程序：在不同的PCR仪器上 PCR程序不同，请按说明书设定需要的程序。程序循
42、环数温度恒温时间采样模式分析模式119510 min无无245953 sec无定量分析6050 sec单次7220 sec无31385 sec无无注意事项：注意事项：程序循环数温度恒温时间采样模式119510 min无2459510 sec无5850 sec采集荧光31385 sec无Roche LightCycler热循环仪上设定如下程序：热循环仪上设定如下程序：在循环第二步60时收集荧光信号，收集方式为SINGLE；仪器检测通道选择通道 1；其他为默认值。ABI7000、博日、博日Linegene热循环仪上设定如下程序：热循环仪上设定如下程序：ABI7000选 FAM为报告荧光，淬灭荧光为
43、None，Passive Reference选择None。博日Linegene选第一通道为报告荧光，增益值设定为68。荧光试剂盒的使用方法（适用于13高危和12+2）（3)分析结果：分析结果：基线：是背景曲线的一段，范围从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要进入对数期，但是还未超出背景。C(t)value 对数期荧光阈值平台期基线荧光信号量PCR循环次数阈值：荧光超过本底时的临界数值。荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时 要尽量选择进入指数期的最初阶段。Ct值：PCR扩增过程中，扩
44、增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数基线，阈值的设定：基线，阈值的设定：LightCycler用荧光显示模式F1读取结果。基线和阈值设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且CT 值不出现任何数值为准。ABI7000基线的确定为：取315个循环的荧光信号；阈值设定：使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值为Undet。质控对照质控对照阴性对照阴性对照CtCt值均应显示为值均应显示为UndetUndet。阳性对照阳性对照CtCt值值3636。符合以上两个条件，此反应是为有效。符合以上两个条件，此反应是为有效。结果判断结果判断样品的样品的Ct
45、Ct值显示为值显示为UndetUndet，判断为阴性。，判断为阴性。样品的样品的CtCt值值4040，判断为阳性；，判断为阳性；若为若为4040CtCt值值4545的样本建议重做，重做的样本建议重做，重做结果结果CtCt值值4040者为阳性，否则为阴性。者为阳性，否则为阴性。凯普公司HPV检测的金牌产品n21HPV分型、分型、13 HPV 荧光和荧光和12+2 HPV 荧光检测是凯普公司荧光检测是凯普公司HPV检检测的金牌产品，具有准确、临床符合性、灵敏性、特异性高和操作省测的金牌产品，具有准确、临床符合性、灵敏性、特异性高和操作省时、简单等优点。时、简单等优点。n21HPV分型经过多年的推广
46、，大量客户的使用，现在是中国在分型经过多年的推广，大量客户的使用，现在是中国在HPV检检测试剂盒的市场占有率排第一的产品。已证明是目前市场上技术含量测试剂盒的市场占有率排第一的产品。已证明是目前市场上技术含量最高、为临床提供最多信息的优质产品。最高、为临床提供最多信息的优质产品。n13 HPV荧光检测操作简单，不需要专用仪器、收费很低，可作为经荧光检测操作简单，不需要专用仪器、收费很低，可作为经济欠发达地区主推的产品，它注定将会成为一个明星产品，而被客户济欠发达地区主推的产品，它注定将会成为一个明星产品，而被客户大量使用。大量使用。n12+2 荧光检测检测区域设计在荧光检测检测区域设计在HPV
47、基因组基因组E区，避免造成漏检。该检区，避免造成漏检。该检测试剂对检测仪器设备要求较高，需要起码测试剂对检测仪器设备要求较高，需要起码4个通道的荧光个通道的荧光PCR仪，仪，而多通道荧光而多通道荧光PCR仪一般只在经济条件好的医院才拥有。所以该方法仪一般只在经济条件好的医院才拥有。所以该方法更适合于在国内经济发达地区及国际市场推广。更适合于在国内经济发达地区及国际市场推广。STD患者检测HPV的必要性 根据美国大学妇产科，美国癌症协会，美国预防服务工作小组，美国阴道镜和宫颈病理学协会的指导方针，建议对STD患者进行HPV普查服务。创新专业创新专业追求卓越追求卓越良心品质良心品质科学管理科学管理Thank you for your attention!