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1、逆流色谱技术逆流色谱技术蒋志国蒋志国海南大学食品学院海南大学食品学院n掌握逆流色谱技术原理、仪器类型、系统构成、应用领域；逆流色谱技术与其它色谱技术比较的优缺点；如何将逆流色谱技术应用于食品科技领域。u重重点点内内容容：逆流色谱技术原理、逆流色谱技术与其它色谱技术比较的优缺点u难难点点内内容容：如何将逆流色谱技术应用于食品科技领域逆流色谱技术历史 Y.Ito et al,Nature,212,985,1966.(现象)Y.Ito and R.L.Bowman,Science,167,281,1970.(封闭型)Y.Ito and R.L.Bowman,Science,173,420,1971.
2、(流通型)Y.Ito and R.L.Bowman,Science,182,391,1973.(双水相)Y.Ito,J.Suaudeau and R.L.Bowman,Science,189,999,1975(非同步).Dr.YoichiroItodiscoveryn 运动螺旋管内两液相对流分配的现象，是逆流色谱的物理基运动螺旋管内两液相对流分配的现象，是逆流色谱的物理基础。这一现象是础。这一现象是DrIto于于1966年在日本大版大学医学院首先年在日本大版大学医学院首先发现的发现的，随后，DrIto赴美在美国国家健康研究院(NIH)工作，于1970、1971年两次在“Scince”杂志上发表
3、了对该技术基本模型的研究结果。此后他针对抗生素、肽、氨基酸等特定样品的分离课题，在实验室不断完善相应的试验模型与实验样机，获得了一系列的发明专利，发表了一系列的研究论著，为逆流色谱技术的发展打下了初期的基础。n1980年，年，张天佑张天佑的小组研制出我国第一台逆流色谱仪器的小组研制出我国第一台逆流色谱仪器，并由检定所抗生素室用于抗生素成分的分离与分析检定。随后在蔡定国教授等植物药学专家的帮助与合作之下，完成了首批生物碱、黄酮等类中药成分的分离应用研究，其结果发表后引起了国内外的关注。这些工作使我国在逆流色谱技术及其应用研究方面处于国际的前列。n2006年，杜琪珍杜琪珍创立了低速逆流色谱技术创立
4、了低速逆流色谱技术，并因此荣膺获得国际逆流色谱协会颁发的最高奖爱德华周（Edward Chou Award）奖。两相在管路中的流动与分布两相在管路中的流动与分布极低速极低速(300rpm):行星式行星式保留好保留好混合混合自转式自转式保留好保留好无混合无混合逆流色谱技术原理 n高速逆流色谱是建立在一种特殊的流体动力学平衡的基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的不对称离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂反复进行着混合和静置的分配过程。流动相不断穿过固定相，随流动相不断穿过固定相，随流动相进入螺旋柱
5、的溶质在两相之间反复分配，按分流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小次序被依次洗脱。配系数的大小次序被依次洗脱。高速逆流色谱仪器的装置n它的公转轴水平设置，螺旋管柱距公转轴R处安装，两轴线平行。通过齿轮传动，使螺旋管柱实现在绕仪器中心轴线公转的同时公转的同时，绕自转轴作相同方向相同角速度的自转。高速逆流色谱分离过程n达到稳定的流体动力学平衡态后，在对管柱里两相溶剂状态进行频闪观察频闪观察时发现，管柱里会出现如下图所示的两个绝然不同的分布区带分布区带：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，呈现两相的激烈混合(混合区混合区)；其余区域两溶剂相分成两层(静置区静置区)，较重的溶剂相
6、在外部，较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。n图图(a)所示为螺旋管在连续转动的不同位置(I、)时，观察到的其中两相分布情况。n图图(b)则表示将对应于不同位置(I、1V)的螺旋管拉直，以更明显地表示混合区域在螺旋管内的移动，即每个混合区带都向螺旋管的首端进行，其行进速率和管柱的公转速率相同。n表明，当流动相恒速通过固定相时，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800 r/min旋转时，频率超过13次/s，所以高速逆流色谱有相当高速逆流色谱有相当高的分配效率高的分配效率。高速逆流色谱优点 应用范用范围广，适广，适应性好性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无
7、限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。操作操作简便，容易掌握便，容易掌握。分离过程中对样品的前处理要求低，仅需一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。回收率高回收率高。由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，理论上样品的回收率可达100。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。高速逆流色谱优点 重现性好重现性好。如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，那么多次进样，其分离过程稳定性都保持很
8、好、峰的保留相对标准偏差也小于2%，重现性相当好。分离效率高分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高。研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。因此，在80年代后期被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。高速逆流色谱溶剂系统的选择n高速逆流色谱是利用组分在逆向移动的互不相溶的两相中的分配行为的差异，即分配系数的差异分配系数的差异，而实现不同组分的分离。首先，根据相应化学成分的溶解特性和极性强弱，选择相应的两相溶剂体系；然后通过测定相应成分在不同比例溶剂体
9、系中的分配分配系数系数确定溶剂体系中各种溶剂的具体比例，从而确定最佳高速逆流色谱分离的两相溶剂系统。分配系数的测定薄层色谱法薄层色谱法:高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)：取适量样品溶于一定体积的某一相中(上相U)，用HPLC测定U相，所得组分的峰面积记为Au1，；然后加入一定体积的另一相(下相L)，振荡分配平衡后用HPLC再测定U相，所得组分的峰面积记为AU2。根据下式计算各个组分的分配系数：n适宜的两相溶剂体系应是组分的分配系数适宜的两相溶剂体系应是组分的分配系数K在在0.52之间。之间。n如果分配系数太小，组分的保留时问太短，不利于分离；如果分配系数太大，则保留时间太长，组分峰展宽
10、严重，峰高降低，峰型变差，严重时无法进行峰的区分。n对于要分离的两组分，两组分分配系数之比K2K11.2，即Rs=1，即可得到较好的分离效果，此时两组分峰重叠约为2；两组分分配系数之比K2K1 1.3，即Rs=1.5，可得到良好的分离效果，此时两组分峰重叠小于1。在进行高速逆流色谱分离条件优化时，可以以此为依据进行两相溶剂系统的选择。分配系数的选择分离机理TR=V(1+(K-1)SFFcTR保留时间V柱体积K被分离组分的分配系数SF固定相保留率Fc流动相流速逆流色谱的溶剂系统逆流色谱的溶剂系统卤代烷-水系列烷烃-水系列乙酸乙酯-水非水相系列双水相系列1.11卤代烷系列卤代烷系列氯仿 -0.2m
11、ol/L磷酸钾缓冲液氯仿 -甲醇 -水 5:6:4氯仿 -甲醇 -水4:4:2氯仿 -甲醇 -水7:13:8氯仿 -甲醇 -水5:4:3氯仿 -甲醇 -水 13:23:13氯仿 -甲醇 -水4:3:2氯仿 -甲醇 -水 10:10:6氯仿 -甲醇 -水 10:10:5氯仿 -甲醇 -水 13:7:8氯仿 -甲醇 -0.5%盐酸5:5:3氯仿 -甲醇 -1乙酸 2:2:1氯仿 -甲醇 -0.5%乙酸5:5:3氯仿 -甲醇 -0.5%氢溴酸5:5:3氯仿 -甲醇 -正丁醇 -水7:6:3:4氯仿 -甲醇 -正丙醇 -水 5:6:1:4氯仿 -甲醇 -异丙醇 -水 5:6:1:4氯仿 -甲醇 -异丁
12、醇 -水 7:6:3:4氯仿 -苯 -甲醇 -水 5:5:7:2四氯化碳 -甲醇 -水5:4:1四氯化碳 -甲醇 -水 5:4:1四氯化碳 -氯仿 -甲醇 -水2:2:3:1四氯化碳 -二氯甲烷 -甲醇 -水 5:5:6:4二氯甲烷 -甲醇 -水5:3:1二氯甲烷 -己烷 -甲醇 -水 20:5:17:8二氯甲烷 -己烷 -甲醇 -水1:4:5:3，二氯甲烷 -己烷 -甲醇 -水2:5:4:3卤代烷系列卤代烷系列 乙酸乙酯系列乙酸乙酯系列 乙酸乙酯 -己烷 -甲醇 -水 8:2:5:5乙酸乙酯 -环己烷 -甲醇 -水 5:4:3:3乙酸乙酯 -石油醚 -甲醇 -水 1:1:1:1乙酸乙酯 -乙
13、醇 -水 2:1:2乙酸乙酯 -正丙醇 -水 35:2:2乙酸乙酯 -正丙醇 -水 140:8:80乙酸乙酯 -己烷 -甲醇 -水 16:8:7:10乙酸乙酯 -乙醇 -水2:1:2乙酸乙酯 -己烷 -正丙醇 -水（pH2）7:0.5:0.4:4乙酸乙酯 -己烷 -甲醇 -水 2:1:1:1乙酸乙酯 -甲醇 -水4:1:3乙酸乙酯 -正丙醇 -水35:2:20乙酸乙酯 -正丁醇 -水 3:2:5乙酸乙酯 -正丁醇 -水 3:2:5乙酸乙酯 -正丁醇 -水4:1:5丁醇系列丁醇系列 正丁醇 -正丙醇 -水4:1:5正丁醇 -乙酸乙酯 -水 2:2:5正丁醇 -正丙醇 -水2:1:3正丁醇 -丙酮
14、 -水 8:3:10正丁醇 -正己烷 -水 4:1:5正丁醇 -甲基叔丁基醚-乙腈 -水 4:1:1:5正丁醇 -甲基叔丁基醚-乙腈 -水 2:1:1:5正丁醇 -甲基叔丁基醚-乙腈 -水 2:2:1:5烷烷烃烃系系列列 己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水3:2:3:2己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 17:7:13:3己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水9:1:5:5己烷 -乙酸乙酯 -乙醇 -水6:3:2:5己烷 -乙酸乙酯 -乙腈 -水8:5:7:1己烷 -乙酸乙酯 -正丁醇 -乙酸 -盐酸12:1:3:1:5己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -0.5%氯化钠 6:4:5:5己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -0.
15、5%氯化钠 7:3:5:5己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -0.5%氯化钠 6:4:5:5己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -0.5%氯化钠 7:3:5:5环己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 3:2:2:2环己烷 -丙酮 -乙醇 -水7:6:1:3环己烷 -乙酸乙酯 -丙酮 -水 5:3:4:5戊烷 -叔丁基甲基醚 -甲醇 -水 10:1:10:1异辛烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水7:3:6:4石油醚 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 10:5:5:1石油醚 -乙酸乙酯 -乙醇 -水 9:3:7:2非水相系列系列非水相系列系列 己烷 -乙腈己烷 -甲醇己烷 -丁醇 -甲醇5:1:5己烷 -丁醇 -乙腈5:1:5己烷 -
16、乙酸乙酯 -乙腈 -甲醇 5:2:5:4双水相系列双水相系列 16%(w/w)PEG 1000-12.5%(w/w)potassium phosphate at pH 8.0 and pH 9.216%(w/w)PEG 1000-8.3%(w/w)potassium phosphate at pH 7.0逆流色谱的应用领域小分子有机物（如黄酮、糖甙、单宁生物碱、维生素等）蛋白质、核酸等活性大分子（海产品中的活性蛋白，活性多肽）细胞（血球细胞，酵母细胞等）无机成分（稀土元素）既可作为实验室分离手段，又能用于制药行业的工业化分离纯化High-speedcountercurrentchromatog
17、raph(HSCCC)高速逆流色谱仪Rotational speed:500rpmThedesignprincipleoftheplanetarycentrifugesystemforHSCCC行性式运转高速逆流色谱仪设计原理行性式运转高速逆流色谱仪设计原理Across-sectionalviewoftheoriginalHSCCC高速逆流色谱仪剖面图高速逆流色谱仪剖面图立式柱高速逆流色谱仪立式柱高速逆流色谱仪BrunelUniversity,UK.Eachcolumn:45m,3.6mmi.d.stainlesssteelTotalcapacity:930ml.花青菜花青菜20gglucor
18、aphaninsfrombroccoliwasseparatedtoyield1.8gglucoraphaninwithhighpurity.4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷甲基亚磺酰丁基芥子油苷Eachcolumnmadeof29mof10mmborePFAtubingTotalcapacityof4.6L,A25gmixtureofbenzylalcoholand-cresolSolventsystemcomposedofheptane-ethylacetate-methanol-water(1.4:0.1:0.5:1.0)Flowrateof600ml/minExcellentresoluti
19、on.HSCCCScale-upbytwocolumnsconnectedinseriesHSCCCequippedwithtriplecolumnsinseries三柱串联高速逆流色谱仪三柱串联高速逆流色谱仪高速逆流色谱仪(总柱容积:2460 ml),可用于克量级制备HSCCCseparationof3gofcrudeisoflavonesobtainedfromthe1200-mlcapacityconvolutedcolumn.Experimentalconditions:column,1200-mlcapacity;sample,3gofcrudeisoflavones(异黄酮异黄酮)
20、;solventsystem,hexaneethylacetate-butanolethanolaceticacidwater(1:2:1:1:5:1,v/v);mobilephase,loweraqueousphase:flow-rate,5ml/min;revolution,700rpm.HSCCCseparationchromatogramofteaextract(茶提取物茶提取物)withthePharma-Techapparatusequippedthreeseriallyconnectedmultilayercolumns(850ml).Conditions:solventsyst
21、em,n-hexane-ethylacetate-water(1:7:10);stationaryphase,upperorganicphase;flowrateof2.5ml/min;retention:44%;rotationalspeed,650rpm.EGC,epigallocatechin;D,L-C,catechin;EC,epicatechin;EGCG,epigallocatechingallate.HSCCCchromatogramof16gofthedriedleavesextractofAmpelopsis grossedentata(藤茶藤茶).Solventsyste
22、m:n-hexaneethylacetatemethanolwater(1:3:2:4,v/v);stationaryphase:upperphase;flow-rateofthemobilephase:5.0ml/min;revolution:650rpm;retentionofstationaryphase:55%,2460mlcolumn.HSCCCseparationof12gofthecrudeextractofS.marianum(水飞蓟水飞蓟).1,unknown;2,silychristin;3,silytin;4,isosilytin.Hexanen-butanolmetha
23、nolwater(1:4:2:6,v/v),2460-mlcapacitycolumn,HSCCCseparationof8goftheE.segittatum(淫洋藿淫洋藿)crudeextractobtainedfromthetriple-columnCCCinstrument(2460ml).Solventsystem:n-hexanen-butanolmethanolwater(1:4:2:6,v/v);stationaryphase:upperphase;flow-rate:5.0ml/min;revolutionspeed:650rpm;retentionofstationaryp
24、hase:46%.Slowrotarycountercurrentchromatograph低速逆流色谱仪低速逆流色谱仪rotating the coil slowly around its horizontal axis at a critical speed(临界转速)that yields high retention of the stationary phase 20-150 rpm杜琪珍 2006年，第四届国际逆流色谱学术会议上，杜琪珍在低速逆流色谱技术建立中作出的突出贡献受到逆流色谱创立者、美国著名科学家Yoichiro Ito博士及与会专家的高度评价，并因此荣膺获得国际逆流色谱
25、协会（International Society for Countercurrent Chromatography）首次设立并颁发的最高奖爱德华周（Edward Chou Award）奖。爱德华周奖，是为纪念为逆流色谱技术在全世界范围内的推广作出杰出贡献的爱德华周博士而设立的。该奖今年首次设立今后将每两年颁发一次，每次只有一名科学家获此殊荣 Cutawayviewofslowrotarycountercurrentchromatographwitha10litercapacitycolumn低速逆流色谱仪剖面图低速逆流色谱仪剖面图低速逆流色谱仪(柱容积:10400 ml),可用于10-100
26、克级制备8.5mmI.DconvolutedtubingPreparativechromatogramofpuerariarootextract(葛葛根提取物根提取物).Experimentalconditions:sample,30gofpeerariarootextractin300mlofsolventconsistingofequalvolumeofeachphase;solventsystem,n-hexane-ethylacetate-n-butanol-water-aceticacid(1:1:2:6:0.2);mobilephase,lowerphase;elutionmode
27、,headtotail;flowrate,5ml/min;columnrotation,21rpm.Preparativechromatogramofcrudeextractoftealeavesobtainedbythepresentmethod.Experimentalconditions:sample,150goftealeavesextract(茶提取物茶提取物)dissolvedin1.2Lofsolventconsistingofequalvolumesofeachphase;solventsystem,n-hexane-ethylacetate-I-butanol-water-a
28、ceticacid(0.5:1:2:6:0.2);mobilephase,lowerphase;elutionmode,headtotail;flowrate,5mL/min;columnrotation,21rpmSketch of slow rotary CCC with rotary seals Scaleupwith17mmI.Dconvolutedtubing用用17mmI.D螺纹管放大螺纹管放大40升低速逆流色谱仪Solventsystem:Secret;Stationaryphase:Upperorganicphase;Rotaryspeed:70rpm;Sampleamount
29、:500gofpuerariarootextractin3000mllowerphase;Mobileflowrate:50ml/min.pH区带逆流色谱技术pH区带逆流色谱(pH-zone-refining CCC)是分离制备离子型化合物的一种有效方法。它利用溶质具有酸、碱特性来进行聚焦和分离，它具有高分辨率，能分离和纯化许多具备酸碱特征的有机化合物。溶质的分配系数与标度值的差异决定了出峰时间，从而实现分离。目前，pH区带逆流色谱技术已成功地应用于下列物质的酸性或碱性衍生物：生物碱、多肽、氨基酸、染料、吲哚类植物激素、结构异构体、光学异构体等。DNP氨基酸的pH区带逆流色谱分离.在流动相中分
30、配添加乙酸、丙酸、丁酸离子对逆流色谱技术离子对逆流色谱(ion-pairing CCC)是制在固定相中加入离子对配位体，以改变被分离组分分配系数的逆流色谱方法。实验中使用较多的离子对是DEHPA，它已广泛应用于分离稀土元素、儿茶酚胺和多肽。它为分离同系物，结构相似的化合物提供了有效的途径。手性逆流色谱技术用逆流色谱分离外消旋对语映体手性化合物。采用溶剂系统正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水，在固定相加入手性选择体N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺可分离系列N-（3，5-dintrobenzoyl）-D，L-氨基酸。逆流色谱系统构成储液瓶 输液泵 进样装置 逆色谱仪 检测器 部分收集器逆流色谱
31、仪系统逆流色谱仪系统Pharma-Tech逆流色谱分离系统PC-Inc.逆流色谱分离系统Pharma-Tech高速逆流色谱仪SLCCC System低速逆流色谱仪(柱容积:升),可用于100-1000克级制备与其它色谱比较的优点与其它色谱比较的优点逆流色谱技术是近三十年来发展起来的一种液液色谱技术。该技术有以下几方面的优点：能构成连续、自动、高效和非高压的色谱系统，其分离的效率可与高效液相色谱相比。既能用于未经严格预处理的大量粗制样品的分离，又能用于高纯度单体的分离。能在一个流程中分离复杂样品中极性差异极大的各个组分，特别是能有效地分离强极性的组分。仪器设备简单、价廉、操作方便、样品无损耗或沾
32、染、溶剂用量少、处理样品大等优点。从根本上消除传统柱色谱分离（硅胶、聚酰胺、凝胶、合成键合相材料等）的不可逆吸附现象，样品在分离后可以100%回收。逆流色谱在食品科学领域的应用逆流色谱在食品科学领域的应用资源有效成分研究报告穿心莲穿心莲内酯J.Chromatogr.A三七人参皂甙、三七皂甙J.Chromatogr.A水曲柳三种黄酮类化合物Phytochemical Analysis红曲lovastatinJ.Liq.Chromtaogr.藤茶黄酮黄酮苷J.Chromatogr.A越橘花色苷J.Chromatogr.A冬瓜黄酮类化合物J.Liq.Chromtaogr.脂化茶多酚EGCGHJ.Chromatogr.AThank you for your attention.