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1、【】高速逆流色谱技术高速逆流色谱技术 在天然产物分离中的应用在天然产物分离中的应用APPLICATION OF HSCCC IN SEPARATION OF NATURAL PRODUCTSProf.LING-YI KONGNature传统的天然产物化学研究工作传统的天然产物化学研究工作Column ChromatographyThin Layer ChromatographyTraditional Research Work of Natural Products Chemistry传统的天然产物化学研究工作，百分之九十左右的时间在传统的天然产物化学研究工作，百分之九十左右的时间在和一根柱子
2、，一块板子打交道。和一根柱子，一块板子打交道。如何实现分离手如何实现分离手段的多样化？段的多样化？如何提高研究如何提高研究工作的效率？工作的效率？如何实现分离工作如何实现分离工作的仪器化，自动化，的仪器化，自动化，程序化？程序化？如何利用各种仪器如何利用各种仪器的互补功能设计新的互补功能设计新的分离思路，创造的分离思路，创造新的分离手段？新的分离手段？Where is the way out?高速逆流色谱仪的出现，使得天然产物高速逆流色谱仪的出现，使得天然产物高速逆流色谱仪的出现，使得天然产物高速逆流色谱仪的出现，使得天然产物工作者看到了一丝曙光工作者看到了一丝曙光工作者看到了一丝曙光工作者看
3、到了一丝曙光Appearance of HSCCC Our hope HSCCC HSCCC分离天然产物方法学研究分离天然产物方法学研究 HSCCC HSCCC分离香豆素类化学成分研究分离香豆素类化学成分研究 HSCCC HSCCC分离黄酮类化学成分研究分离黄酮类化学成分研究 HSCCCHSCCC分离生物碱类化学成分研究分离生物碱类化学成分研究 HSCCC HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究系统分离植物提取物化学成分研究 HSCCC HSCCC联用分离技术研究联用分离技术研究主要内容：主要内容：Contents:Methodology research of HSCCC in separ
4、ation of natural productsResearch of HSCCC in separation of coumarinsResearch of HSCCC in separation of flavonoidsResearch of HSCCC in separation of alkaloidsResearch of HSCCC in systematic separation of plant extractResearch of HSCCC coupled with other instruments研究思路研究思路 Research patternHPLC分析方法的建
5、立分析方法的建立HSCCC溶剂系统的选择溶剂系统的选择(分配系数的测定分配系数的测定)HSCCC分离条件优化及分离条件优化及HSCCC分离纯化分离纯化化合物纯度测定化合物纯度测定化合物结构鉴定化合物结构鉴定样品制备样品制备重要成分活性研究重要成分活性研究HSCCC分离天然产物方法学研究分离天然产物方法学研究Methodology research of HSCCC in separation of natural products分分离方法建立步骤：离方法建立步骤：1.1.根据化合物极性、溶解性特点，结合同类型根据化合物极性、溶解性特点，结合同类型化合物研究文献，确定备选溶剂系统。化合物研究文
6、献，确定备选溶剂系统。2.2.建立目标化合物的建立目标化合物的TLCTLC、HPLCHPLC分析条件。分析条件。3.3.由所建立的由所建立的HPLCHPLC分析条件准确测定各目标分析条件准确测定各目标化合物在备选溶剂系统中的分配系数。化合物在备选溶剂系统中的分配系数。4.4.由分配系数估算相应保留时间，分离度及峰由分配系数估算相应保留时间，分离度及峰宽等色谱参数。宽等色谱参数。5.5.选择性的选取具有适宜色谱参数的溶剂系统选择性的选取具有适宜色谱参数的溶剂系统进行预试。进行预试。6.6.优化预试条件，确立最佳条件。优化预试条件，确立最佳条件。Process of method developm
7、ent水溶性和强极性水溶性和强极性正丁醇正丁醇-醋酸醋酸-水水正丁醇正丁醇-甲醇甲醇-水水(缓冲液缓冲液)正丁醇正丁醇-乙酸乙酯乙酸乙酯-水水(缓冲液缓冲液)乙酸乙酯乙酸乙酯-水水(缓冲液缓冲液)中等极性中等极性(氯仿溶解氯仿溶解)氯仿氯仿-甲醇甲醇-水水乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水正己烷正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水)弱极性弱极性(正己烷溶解正己烷溶解)正己烷正己烷-乙腈乙腈正己烷正己烷-甲醇甲醇-水水正己烷正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水)天然产物天然产物HSCCCHSCC
8、C溶剂系统选择溶剂系统选择（皂苷、强心苷、黄（皂苷、强心苷、黄 酮苷、多酚类等）酮苷、多酚类等）（香豆素、醌类、苯丙（香豆素、醌类、苯丙 素、生物碱、黄酮等）素、生物碱、黄酮等）（萜类、甾体、脂肪酸等）（萜类、甾体、脂肪酸等）Selection of solvent systems HPLCHPLC法测定分配系数的理论基础法测定分配系数的理论基础 （上相）（上相）Theoretical base of K-value determination by HPLC分配系数分配系数(K(KD D)与保留因子与保留因子()关系研究关系研究（VRVM）/VM KD（VS/VM）KD 相比相比VR VM
9、KDVS Relationship of KD and K分配系数分配系数(K)(K)与分离度与分离度(Rs)(Rs)关系研究关系研究Relationship of K and Rs0.821.272.023.004.485.13HSCCCHSCCC峰宽度与分配系数峰宽度与分配系数K K的关系的关系分配系数分配系数保留时间保留时间(min)色谱峰宽色谱峰宽(min)0.82118.210.41.27147.715.22.02196.223.23.00260.334.74.48355.952.95.13398.860.9Relationship of K and peak width峰宽分配系数
10、关系图峰宽分配系数关系图保留时间峰宽分配系数关系图保留时间峰宽分配系数关系图分离度与分配系数关系分离度与分配系数关系在螺旋管体积为在螺旋管体积为300ml，相比为，相比为1，流速为，流速为2ml/min时，时，tM=75min K2/K1 1.2：Rs1.0,两组分峰重叠小于两组分峰重叠小于2%K2/K1 1.31：Rs1.5,两组分峰重叠小于两组分峰重叠小于1%两组分分离程度的判断依据两组分分离程度的判断依据HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究系统分离植物提取物化学成分研究HSCCCHSCCC分离香豆素类化学成分研究分离香豆素类化学成分研究Research of HSCCC in sep
11、aration of coumarins白花前胡白花前胡P.praeruptorum Dunn.紫花前胡紫花前胡P.decursivum(Miq.)Maxim前前胡胡 Qian-hu1 1 化学成分研究进展化学成分研究进展 以香豆素类化合物为主以香豆素类化合物为主 白花前胡白花前胡:以以7,8-7,8-二氢吡喃骈香豆素二氢吡喃骈香豆素类化合物为主类化合物为主 紫花前胡紫花前胡:以以6,7-6,7-二氢吡喃骈香豆素二氢吡喃骈香豆素类化合物为主类化合物为主2 2 药理研究进展药理研究进展 心血管系统保护作用心血管系统保护作用 抗血小板凝集作用抗血小板凝集作用 抗过敏作用抗过敏作用 祛痰作用祛痰作用
12、 抗癌作用抗癌作用 白花前胡和紫花前胡石油醚提取物白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HPLCHPLC色谱图色谱图色谱柱：色谱柱：SPHERIGEL ODS C18 SPHERIGEL ODS C18(250 mm 4.6 mm I.D.,5 m)(250 mm 4.6 mm I.D.,5 m)流动相：乙腈流动相：乙腈-水水梯度洗脱模式：梯度洗脱模式：0-15 min0-15 min，乙腈比例由，乙腈比例由50%50%线性线性变为变为60%60%15-30 min15-30 min，由，由60%60%线性变为线性变为70%70%35min35min后，后，70%70%乙腈乙腈 色谱柱：色谱柱：SPH
13、ERIGEL ODS C18 SPHERIGEL ODS C18(250 mm 4.6 mm,5 m)(250 mm 4.6 mm,5 m)流动相：乙腈流动相：乙腈-水水梯度洗脱模式：梯度洗脱模式：0-24min0-24min，50%50%乙腈乙腈24-40min24-40min，乙腈由，乙腈由50%50%线性变为线性变为65%65%分离条件的摸索分离条件的摸索针对香豆素类化合物具有较低极性的特点，采用经济适用环保的针对香豆素类化合物具有较低极性的特点，采用经济适用环保的石石油醚油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:47:63)系统，流速系统，流速12ml/min，分离温度分离温度2
14、035 C，根据等度洗脱各峰保留时间以及分离度决定，根据等度洗脱各峰保留时间以及分离度决定是否采用梯度模式以及相应梯度条件。是否采用梯度模式以及相应梯度条件。分离条件分离条件溶剂系统溶剂系统螺旋管的转速螺旋管的转速流动相的流速流动相的流速分离温度分离温度梯度模式梯度模式Solvent systemFlow rateRevolution speedColumn temperatureGradient modeSeparation condition溶剂系统（溶剂系统（v/v）K(I)K(II)K(III)K(IV)石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水 (5:5:5:5)1.101.74
15、4.4810.32石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:5.5:4.5)0.831.272.817.65石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水 (5:5:6:4)0.430.642.184.99石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:6.5:3.5)0.240.311.282.33白花前胡各溶剂系统的白花前胡各溶剂系统的K K值测定值测定溶剂系统（溶剂系统（v/v）K(I)K(II)K(III)K(IV)K(V)K(VI)乙酸乙酯乙酸乙酯-水水(5:5)11.6-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:1:5)5.72-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(
16、5:2:5)3.03-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:3:5)2.72-石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:4:5)0.42-石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:5:5)0.257.5212.5-石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:6:5)0.174.686.1211.3-石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:7:4)0.071.011.412.183.194.24石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:7:3)0.020.830.931.341.872.15紫花前胡各溶剂系统的紫花前胡各溶剂系
17、统的K K值测定值测定PW=11.726K 推算由及白花前胡白花前胡HSCCCHSCCC溶剂体系中石油醚溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水（水（5:5:5:55:5:5:5）以及（以及（5:5:6.5:3.55:5:6.5:3.5）较为合适，采用梯度洗脱可使各目标化合物均）较为合适，采用梯度洗脱可使各目标化合物均具有较好分离度，适宜的峰宽和保留时间。而紫花前胡具有较好分离度，适宜的峰宽和保留时间。而紫花前胡HSCCCHSCCC溶剂溶剂体系中石油醚体系中石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水（水（5:5:7:45:5:7:4）效果较为理想。）效果较为理想。白花前胡和紫花前胡石油醚提
18、取物白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HSCCCHSCCC色谱图色谱图螺旋管转速：螺旋管转速：900r/min 流动相流速：流动相流速：2.0 mL/min 分离温度：分离温度：35 C 流动相梯度模式：流动相梯度模式：0-150min:石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水（5:5:5:5）的下相的下相 150-300min:由由5:5:5:5的下相线性变为的下相线性变为5:5:6.5:3.5的下相的下相 300min后后:流动相为流动相为5:5:6.5:3.5的下的下相相 螺旋管转速：螺旋管转速：900r/min 流动相流速：流动相流速：2.0 mL/min 分离温度：分离温度：20
19、C 溶剂系统：溶剂系统：石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水（水（5:5:7:4，v/v），上相为固定相，下相为流），上相为固定相，下相为流动相动相Journal of Chromatography A.2004,1057(1-2):89-94.2005,1076(1-2):127-32 Pd-D-V Pd-D-V 是首次以纯化合物形式分离得到，说是首次以纯化合物形式分离得到，说明了明了HSCCCHSCCC方法的分辨能力很高。方法的分辨能力很高。Ostruthin(Ostruthin(欧芹素欧芹素)首次从紫花前胡中分离得首次从紫花前胡中分离得到。到。OstruthinOstruthin
20、的含量并不低，但在以前的研究的含量并不低，但在以前的研究中未从紫花前胡中分离得到，这可能是由于该化中未从紫花前胡中分离得到，这可能是由于该化合物在常规分离过程中易发生变化或易形成死吸合物在常规分离过程中易发生变化或易形成死吸附，这也说明了附，这也说明了HSCCCHSCCC方法的优越性。方法的优越性。小小结：结：conclusionHSCCC系统分离植物提取物化学成分研究系统分离植物提取物化学成分研究HSCCCHSCCC分离黄酮类化学成分研究分离黄酮类化学成分研究Research of HSCCC in separation of flavonoids淫淫羊藿羊藿 Ying Yang Huo 朝
21、鲜淫羊藿朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai.系小檗科淫羊藿属植物系小檗科淫羊藿属植物(Epimedium koreanum Nakai.)的地的地上全草上全草,主产于我国的辽宁、吉林主产于我国的辽宁、吉林等地等地1 1 化学成分研究进展化学成分研究进展 8-8-异戊烯基取代的黄酮类化合物异戊烯基取代的黄酮类化合物2 2 药理研究进展药理研究进展心脑血管、免疫系统、骨代谢、心脑血管、免疫系统、骨代谢、生殖系统等具有广泛的药理作用生殖系统等具有广泛的药理作用,还有抗肿瘤作用还有抗肿瘤作用样品的制备样品的制备60 C干燥干燥粉碎至约粉碎至约30目目1000g药材药材10L70
22、%乙醇回流提取乙醇回流提取2次次浸膏上浸膏上D101大孔大孔吸附树脂柱吸附树脂柱水洗至无色，水洗至无色，5L70%乙醇洗脱乙醇洗脱减压旋转蒸发至干减压旋转蒸发至干11.5 g干粉干粉回收溶剂回收溶剂Preparation of sample色谱柱：色谱柱：YWG CYWG C1818 柱柱(200(200 mm 4.6 mm I.D.,10 mm 4.6 mm I.D.,10 m)m)；流动相：流动相：乙腈乙腈-水水0-12 min:28%0-12 min:28%乙腈乙腈12-20 min:12-20 min:乙腈由乙腈由28%28%线性线性变为变为35%35%30 min:35%30 min
23、:35%乙腈乙腈流动相流速：流动相流速：1.0 mL/min1.0 mL/minHPLC分析方法建立分析方法建立HPLC analysis乙酸乙酯乙酸乙酯-水水：Icariside IIIcariside II的纯度仅有的纯度仅有68.2%68.2%乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:1:5)(5:1:5)：只有只有icariin icariin 的纯度较高，的纯度较高，Icariside II Icariside II 和和 epimedokoreanoside I epimedokoreanoside I 的纯度较低，均不足的纯度较低，均不足80%80%当用当用乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇
24、-水水(5:2:5)(5:2:5)：所有的化合物的纯度均较差。：所有的化合物的纯度均较差。氯仿氯仿-甲醇甲醇-水系统水系统：分离条件的摸索分离条件的摸索根据黄酮极性特点，尝试采用乙酸乙酯根据黄酮极性特点，尝试采用乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:03:5)(5:03:5)，氯仿氯仿-甲醇甲醇-水水(4:2.54:2)(4:2.54:2)等体系：等体系：PW=11.726K 推算由及适宜比例为适宜比例为4:3.5:2，此时各目标化合物均具有较好分离度，合适此时各目标化合物均具有较好分离度，合适的峰宽和保留时间。的峰宽和保留时间。Separation condition螺旋管转速：螺旋管转速：900r
25、/min 流动相流速：流动相流速：2.0 mL/min 分离温度：分离温度：25 C 溶剂系统：溶剂系统：氯仿氯仿-甲醇甲醇-水水 4:3.5:2上相上相为固定相，下相为流动相为固定相，下相为流动相98.7%99.1%98.2%HSCCC色谱图色谱图Journal of Chromatography A.2005,1064(1):53-7 HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究系统分离植物提取物化学成分研究HSCCCHSCCC分离生物碱类化学成分研究分离生物碱类化学成分研究Research of HSCCC in separation of alkaloids吴吴茱萸茱萸 Wu Zhu Yu
26、 吴茱萸吴茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth(E.rutaecarpa),为芸香科植物吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.的近成熟果实，分布陕西、的近成熟果实，分布陕西、甘肃、安徽、浙江、福建、湖北、湖南、甘肃、安徽、浙江、福建、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广东和广西等省区。四川、贵州、云南、广东和广西等省区。秋季果实将近成熟尚未开裂时采收，除秋季果实将近成熟尚未开裂时采收，除去果柄，晒干或烘干。去果柄，晒干或烘干。1 1 化学成分研究进展化学成分研究进展主含生物碱：吴茱萸碱、吴茱萸次碱、主含生物碱：吴茱萸碱、吴茱
27、萸次碱、吴茱萸因碱、羟基吴茱萸碱、吴茱萸卡吴茱萸因碱、羟基吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱。品碱。2 2 药理研究进展药理研究进展胃肠道作用，镇痛，中枢刺激，止血止胃肠道作用，镇痛，中枢刺激，止血止泻等泻等色谱柱：色谱柱：SPHERIGEL ODS SPHERIGEL ODS C18(250mm4.6mm C18(250mm4.6mm I.D.,I.D.,5um)5um)流动相：流动相：甲醇甲醇-乙腈乙腈-水水0-22 min:15:38:470-22 min:15:38:4722-65 min:45:38:1722-65 min:45:38:17流动相流速：流动相流速：1.0 mL/min1.0 mL
28、/min检测波长：检测波长：254nm254nmHPLC分析方法建立分析方法建立吴茱萸乙酸乙酯超声提取物（生物碱部位）吴茱萸乙酸乙酯超声提取物（生物碱部位）HPLC analysis乙酸乙酯乙酸乙酯-水水：生物碱基本分布于固定相中；：生物碱基本分布于固定相中；乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水：当甲醇含量稍高时系统不易分层；当甲醇含量稍高时系统不易分层；环己烷乙酸乙酯甲醇水环己烷乙酸乙酯甲醇水：在引入环己烷后改善了系统分层：在引入环己烷后改善了系统分层状况。其中甲醇比例较小时，出峰延迟，峰型过宽；甲醇比例较状况。其中甲醇比例较小时，出峰延迟，峰型过宽；甲醇比例较大时固定相保留不理想。大时固定相保
29、留不理想。分离条件的摸索分离条件的摸索根据此类生物碱极性特点，尝试采用乙酸乙酯根据此类生物碱极性特点，尝试采用乙酸乙酯-水，乙酸乙酯水，乙酸乙酯-甲醇甲醇-水，环己烷水，环己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水(5:5:57:5)(5:5:57:5)等体系：等体系：PW=11.726K 推算由及确定适宜比例为5:5:7:5。Separation conditionHSCCC色谱图色谱图螺旋管转速：螺旋管转速：900r/min 流动相流速：流动相流速：2.0 mL/min 分离温度：分离温度：25 C 溶剂系统：溶剂系统：环己烷环己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水 5:5:7:5上相为固定相
30、，下上相为固定相，下相为流动相相为流动相Journal of Chromatography A,1074(2005)139144HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究系统分离植物提取物化学成分研究HSCCCHSCCC系统分离植物提取物化学成分研究系统分离植物提取物化学成分研究Research of HSCCC in systematic separation of plant extract 天天然药物的总提取物往往含有从脂溶性到水溶性的具有广泛然药物的总提取物往往含有从脂溶性到水溶性的具有广泛极性的一系列化学成分，若仅仅对其中主要成分进行极性的一系列化学成分，若仅仅对其中主要成分进行HSC
31、CCHSCCC分离分离，不仅无法全面反映与活性相关的物质基础，而且以一种溶剂系统，不仅无法全面反映与活性相关的物质基础，而且以一种溶剂系统也难以一次性实现彻底的分离。若采用传统的系统溶剂分离法，将也难以一次性实现彻底的分离。若采用传统的系统溶剂分离法，将总提取物用不同的溶剂逐步划分为极性从小到大的不同部位，再针总提取物用不同的溶剂逐步划分为极性从小到大的不同部位，再针对不同部位，使用不同对不同部位，使用不同HSCCCHSCCC溶剂系统进一步分离，不仅可以加溶剂系统进一步分离，不仅可以加快整体分离速度，而且有利于追踪主要活性部位，加大有效先导化快整体分离速度，而且有利于追踪主要活性部位，加大有效
32、先导化合物的发现几率，从而使得整个分离工作的系统性、针对性和完整合物的发现几率，从而使得整个分离工作的系统性、针对性和完整性得到了大大增强，最终将促进性得到了大大增强，最终将促进HSCCCHSCCC技术成为天然产物化学研技术成为天然产物化学研究中的常规分离手段，加快天然药物化学研究现代化步伐。究中的常规分离手段，加快天然药物化学研究现代化步伐。蓼科蓼属植物何首乌的块根，原植物蓼科蓼属植物何首乌的块根，原植物广泛分布于四川、云南、河北、河南、广泛分布于四川、云南、河北、河南、山东、广东、广西、福建等省山东、广东、广西、福建等省 1 1 化学成分化学成分醌类化合物醌类化合物二苯乙烯苷类化合物二苯乙
33、烯苷类化合物2 2 药理作用药理作用心血管系统、抗衰老、内分泌系统、心血管系统、抗衰老、内分泌系统、消化系统、血液系统消化系统、血液系统抗肿瘤作用抗肿瘤作用抗病原微生物作用抗病原微生物作用 何首乌He Shou Wu500g500g何首乌药材何首乌药材5L 95%乙醇冷浸乙醇冷浸,回收乙醇回收乙醇浸膏浸膏(28g)(28g)300mL水分散水分散,乙醚萃取乙醚萃取乙醚部位乙醚部位(8.0g)(8.0g)水溶液水溶液正丁醇萃取正丁醇萃取正丁醇部位正丁醇部位(7.5g)(7.5g)水部位水部位(10g)(10g)D101大孔吸附树脂大孔吸附树脂,30%乙醇洗脱乙醇洗脱精制正丁醇部位精制正丁醇部位(
34、3.5g)(3.5g)Separated fractions：Shimadzu VP-ODSShimadzu VP-ODS柱柱(1504.6 mm (1504.6 mm I.D.,5 I.D.,5 m)m)。甲醇甲醇-水梯度洗脱，水梯度洗脱，0-60min0-60min内甲醇由内甲醇由5%5%线性变为线性变为100%100%；1.2mL/min1.2mL/min；254nm254nm。Shimadzu VP-ODSShimadzu VP-ODS柱柱(1504.6 (1504.6 mm I.D.,5 mm I.D.,5 m)m)。乙腈乙腈-水梯度洗脱，水梯度洗脱，0-45min0-45min内乙
35、腈由内乙腈由1%1%线性变为线性变为100%100%；0.8mL/min0.8mL/min；254nm254nm。乙醚部位乙醚部位 精制正丁醇部位精制正丁醇部位HPLCHPLC成分分析成分分析HPLC analysis乙醚部位乙醚部位:主要为化合物主要为化合物I-IVI-IVv采用分步洗脱的方法进行分离采用分步洗脱的方法进行分离 先用正己烷先用正己烷乙酸乙酯乙酸乙酯甲醇甲醇水（水（3:7:5:53:7:5:5）体系使）体系使I I和和II II分离开分离开 再用再用9:1:5:59:1:5:5体系的下相作流动相，将体系的下相作流动相，将IIIIII洗脱出洗脱出 IVIV则留在固定相中，回收固定
36、相得到则留在固定相中，回收固定相得到IVIV精制正丁醇部位精制正丁醇部位:主要为化合物主要为化合物V-IXV-IXv用乙酸乙酯用乙酸乙酯甲醇甲醇水水(50:1:50)(50:1:50)体系进行分离体系进行分离 先洗脱出先洗脱出V V、VIVI、VIIVII 改变改变HSCCCHSCCC仪器螺旋管的旋转方向，同时将流动相变为仪器螺旋管的旋转方向，同时将流动相变为 乙酸乙酯乙酸乙酯甲醇甲醇水水(50:1:50)(50:1:50)上相，将上相，将VIIIVIII和和IXIX洗脱出。洗脱出。分离策略分离策略 separation tactic乙酸乙酯乙酸乙酯甲醇甲醇水水(50:1:50):(50:1:
37、50):固定相：上相固定相：上相流动相：下相流动相：下相300min300min前正转前正转乙酸乙酯乙酸乙酯甲醇甲醇水水(50:1:50):(50:1:50):固定相：下相固定相：下相流动相：上相流动相：上相300min后正转后正转HSCCCHSCCC分离：分离：获得不同极性的一系列化合物获得不同极性的一系列化合物200min200min前流动相为正己烷前流动相为正己烷乙酸乙酯乙酸乙酯甲醇甲醇水水（3:7:5:53:7:5:5）下相，）下相，200min200min后为后为9:1:5:59:1:5:5下相，下相，600min600min后停机吹出固定相后停机吹出固定相 乙醚部位乙醚部位 精制正
38、丁醇部位精制正丁醇部位(先先)精制正丁醇部位精制正丁醇部位(后后)Journal of Chromatography A.2006,1115:64-71.HSCCCHSCCC联用分离技术研究联用分离技术研究Research of HSCCC coupled with other instruments分析仪器分析仪器IRIR、MS MS、TLC TLC、HPLC-DAD HPLC-DAD分离仪器分离仪器HSCCCHSCCCn n 、PHPLC PHPLC、SFESFE检测仪器检测仪器UV-VISUV-VIS、RIDRID、ELSDELSD目前进行目前进行HSCCCHSCCC联用研究时需要考虑以
39、下问题：联用研究时需要考虑以下问题：1 1连接问题：连接问题：目前仅借助通用分流阀来实现。没有专门的接口技术，也没有实现接口的模目前仅借助通用分流阀来实现。没有专门的接口技术，也没有实现接口的模块化和自动化。块化和自动化。2 2流动相问题：流动相问题：HSCCCHSCCC适用的溶剂范围十分宽泛适用的溶剂范围十分宽泛,但与之相连的仪器溶剂范围并不宽泛。但与之相连的仪器溶剂范围并不宽泛。3 3分流问题：分流问题：对于不同检测限的设备，为了达到不同的目的（分析或者制备），需采用不对于不同检测限的设备，为了达到不同的目的（分析或者制备），需采用不同的分流比。同的分流比。4 4杂质的影响：杂质的影响：在
40、在LC-M SLC-M S过程中过程中,复杂样品经分离后再进行质谱分析复杂样品经分离后再进行质谱分析,HPLCHPLC的分离情况对的分离情况对M SM S检测带来较大影响。对于检测带来较大影响。对于HSCCC-M SHSCCC-M S联用分析而联用分析而言言,同样须经同样须经HSCCCHSCCC分离分离,且效果好才能得到满意的质谱信息。且效果好才能得到满意的质谱信息。5 5样品量：样品量：HPLC-FT-IRHPLC-FT-IR的联用一直受到的联用一直受到HPLCHPLC流动相吸收红外光谱的困流动相吸收红外光谱的困扰。采用扰。采用HSCCCHSCCC能够获得高溶质溶剂比的流出物，从而使流动相吸
41、收红能够获得高溶质溶剂比的流出物，从而使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解。但是，它需要较大的样品量（每组分外光谱的问题得到缓解。但是，它需要较大的样品量（每组分0.20.21mg1mg甚甚至更多），这就限制了至更多），这就限制了HSCCC-FT-IRHSCCC-FT-IR在天然产物的研究，尤其是在复杂粗在天然产物的研究，尤其是在复杂粗提物的分离分析中的应用。提物的分离分析中的应用。天天然药物化学成分复杂，有一部分成分不存在紫外吸收或然药物化学成分复杂，有一部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收。加上色谱分离的困难以及流动相带来仅在紫外末端有吸收。加上色谱分离的困难以及流动相带来的干扰，使用
42、传统的的干扰，使用传统的UV-VISUV-VIS对其进行检测分析十分困难。作对其进行检测分析十分困难。作为通用型质量检测器的为通用型质量检测器的ELSDELSD在某种程度上弥补了这方面的在某种程度上弥补了这方面的不足，被广泛的应用于皂苷类成分、糖类成分、内酯类成分、不足，被广泛的应用于皂苷类成分、糖类成分、内酯类成分、部分生物碱类成分以及其他一些成分的分析，取得了满意的部分生物碱类成分以及其他一些成分的分析，取得了满意的结果。再加上其接口简单、连接方便的特点，已成功用作高结果。再加上其接口简单、连接方便的特点，已成功用作高效液相色谱，超临界流体色谱和逆流色谱的检测器。并已经效液相色谱，超临界流
43、体色谱和逆流色谱的检测器。并已经被广泛应用于医药、化工、食品等行业。被广泛应用于医药、化工、食品等行业。但但是，是，ELSDELSD作为一种通用型质量检测器，作为一种通用型质量检测器，同时也是一种破坏性检测器，样品会被载气同时也是一种破坏性检测器，样品会被载气吹至废液瓶中，无法回收。因此需要借助分吹至废液瓶中，无法回收。因此需要借助分流阀的作用，牺牲一部分样品换取对分离过流阀的作用，牺牲一部分样品换取对分离过程的检测，分流比可按照需要调节。程的检测，分流比可按照需要调节。HSCCC-ELSDHSCCC-ELSD连接示意图连接示意图Sketch Map为桔梗科沙参属植物轮叶沙参为桔梗科沙参属植物
44、轮叶沙参(Adenophora tetraphylla(Thunb.)Fisch)、沙参、沙参(A.stricta Miq.).)的干燥的干燥根，分布较广，山东、江苏主产。根，分布较广，山东、江苏主产。1 1 化学成分化学成分甾醇类化合物甾醇类化合物脂肪族化合物脂肪族化合物2 2 药理作用药理作用祛痰作用祛痰作用强心作用强心作用抗真菌作用抗真菌作用促进改善免疫系统作用促进改善免疫系统作用均无紫外吸收均无紫外吸收南沙参 Nan Sha Sheng南沙参粉末南沙参粉末（800g800g）乙醇提取物乙醇提取物（58g58g）乙醚部位乙醚部位（20g20g）水部位水部位（20g20g）大孔树脂纯化后正大孔树脂纯化后正丁醇部位丁醇部位（810mg810mg）样品准备样品准备Preparation of sample乙醚和精制正丁醇部位的乙醚和精制正丁醇部位的HPLC-ELSDHPLC-ELSD分析分析HPLC-ELSD analysis采用正己烷采用正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-乙乙腈和石油醚腈和石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-乙乙醇醇-水系统等度洗脱，一水系统等度洗脱，一步或多次分离得到一系列步或多次分离得到一系列无紫外吸收化合物。无紫外吸收化合物。HSCCC-ELSDHSCCC-ELSD分离分离Journal of Chromatography A,1139(2007)254262