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1、第五章第五章 重组重组DNADNA的获得及目的获得及目的基因导入受体细胞的基因导入受体细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接DNA连连接接酶酶把把相相互互靠靠近近的的5端端磷磷酸酸与与3-OH连到一起连到一起单酶切、双酶切单酶切、双酶切第一节 DNA的体外重组DNADNA的体外重组：的体外重组：将目的基因与载体连接，这将目的基因与载体连接，这种重新组合的种重新组合的DNADNA称为重组称为重组DNADNA。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止
2、、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（一）（一）直接连接直接连接T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的低，只有粘性末端的110%。5 5 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3-OH-PP-HO-5 3 二、平末端（二、平末端（blunt end）的连接）的连接严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（1）同聚加尾法）同聚加尾法 （二）（二）人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端粘性末端”DNA末端转移酶末端转移酶能在没有模板的情况下给能在没
3、有模板的情况下给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾碱基互补加尾碱基互补严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。缺点：缺点：优点：优点：能把任何片能把任何片段连接起来段连接起来操作繁琐；操作繁琐；外源片段难以回收外源片段难以回收同聚物尾巴影响外同聚物尾巴影响外源基因表达。源基因表达。非酶切位点严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（2 2）衔
4、接物（）衔接物（）衔接物（）衔接物（linkerlinker）连接）连接）连接）连接Linker：用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡平末端双链寡核苷酸核苷酸GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker：（二）（二）人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端粘性末端”严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（1）多核苷酸激酶处理）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接连接酶连接（3）限制性内切酶消化）限制
5、性内切酶消化（4）目的片段与载体连接）目的片段与载体连接严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（3 3）DNADNA接头接头接头接头 （adapteradapter）连接法）连接法）连接法）连接法 adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）序列）Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P5 严格执行突发事件上报制度、校外活动报
6、批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。接头与接头以粘末端连接，影响与接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的片段的连接连接 优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先先用用小小牛牛肠肠碱碱性性磷磷酸酸酶酶（CIP）处处理理接接头头，水水解掉其解掉其5端的磷酸，防止自我连接。端的磷酸，防止自我连接。防止自我连接防止自我连接5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-p5 严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。Blunt-ended DNA5p-GATCC
7、CGG-3 GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5HO-GATCCCGG-GGCC CCGG-GGCCCTAG-OH5 5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5 nick缺口缺口nick缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接片断连接T4多核苷酸激酶处理使多核苷酸激酶处理使5磷酸化磷酸化严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。三、三、PCRPCR产物的连接产物的连接1.1.在引物的在引物的55端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位
8、点；符合载体的多克隆位点；（1 1）设计原则）设计原则（2 2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构33端端151520bp20bp与模板互补；与模板互补；55端内切酶识别序列端内切酶识别序列保护碱基保护碱基避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。三、三、PCRPCR产物的连接产物的连接1.1.在引物的在引物的55端设计酶切位点端设计酶切位点严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各
9、类违纪行为或突发事件。带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTC PCR产物产物5-3 CCTAGGCGC PCR产物产物-5 3-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoR I位点位点BamH I位点位点AATTC PCR产物产物5-3 CCTAG PCR产物产物-5 3-GGEcoR I BamH I两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA2.与T载体直接连接严格执行突发事件上报制
10、度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。第二节 受体细胞又称为又称为又称为又称为宿主细胞或寄主细胞宿主细胞或寄主细胞宿主细胞或寄主细胞宿主细胞或寄主细胞(host cell)(host cell)，是是指能够摄取外源指能够摄取外源DNADNA并使其稳定维持、具有应用并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。价值和理论研究价值的细胞。什么是什么是受体细胞受体细胞(receptor cell)？严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。受体细胞选择的基本原则受体细胞选择的
11、基本原则1.便于重组便于重组DNA分子的导入；分子的导入；2.能使重组能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；分子稳定存在于细胞中；3.便于重组体的筛选；便于重组体的筛选；4.遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；5.安全性高，无致病性，不会对外界环境造成安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；生物污染；严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。受体细胞选择的基本原则受体细胞选择的基本原则6.有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外
12、源基因的高效分泌表达。或促进外源基因的高效分泌表达。7.在遗传密码的应用上无明显偏倚性；在遗传密码的应用上无明显偏倚性；8.具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；因的高效表达；9.在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。基因工程中常用的受体细胞类型：基因工程中常用的受体细胞类型：n n原核生物细胞原核生物细胞n n真核生物细胞真核生物细胞真菌细胞真菌细胞植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞*没
13、有纤维素组成的细胞壁，便于外源没有纤维素组成的细胞壁，便于外源DANDAN进入细胞内进入细胞内*染色体裸露，便于外源染色体裸露，便于外源DNADNA重组重组*基因组简单，便于进行遗传分析基因组简单，便于进行遗传分析*单细胞生物，易于获得一致性受体细胞单细胞生物，易于获得一致性受体细胞*培养条件简单，生长快，实验周期短培养条件简单，生长快，实验周期短一、原核生物细胞一、原核生物细胞原核生物受体细胞的特点原核生物受体细胞的特点严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。一、原核生物细胞一、原核生物细胞优优 点：点：1.大部分原核生
14、物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。2.无核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。3.原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。4.基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。一、原核生物细胞一、原核生物细胞缺点：缺点：1.不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链
15、。2.缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。3.原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。至今被用作受体菌的原核生物至今被用作受体菌的原核生物n n大肠杆菌大肠杆菌n n枯草杆菌枯草杆菌n n蓝细菌蓝细菌严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。n n大肠杆菌属大肠杆菌属大肠杆菌属大肠杆菌属革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性
16、菌，它是目前为止研究，它是目前为止研究，它是目前为止研究，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。和成熟的载体受体系统。和成熟的载体受体系统。和成熟的载体受体系统。（一）大肠杆菌受体细胞（一）大肠杆菌受体细胞优点：优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制，易于进行工业化批量生产。严格
17、执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。缺点：缺点：通常情况下，细菌RNA聚合酶不识别真核的启动子许多真核基因的蛋白质产物需经过翻译后的加工修饰，而细菌中没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉；大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（二）枯草杆菌受体细胞（二）枯草杆菌受
18、体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌优点：优点：1.有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（二）枯草杆菌受体细胞（二）枯草杆菌受体细胞应用：应用：已成功的用于表达人的已成功的用于表达人的已成功的用于表达人的已成功的用于表达人的 干扰素、白细胞干扰素、白细胞干扰素、白细胞干扰素、白
19、细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒疫病毒疫病毒疫病毒VPIVPI抗原等。抗原等。抗原等。抗原等。优点：优点：2.不产生内毒素，无致病性，比较安全。3.具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。4.具有生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。蓝藻蓝藻蓝藻蓝藻又称又称又称又称蓝绿藻蓝绿藻蓝绿藻蓝绿藻或或或或蓝细菌蓝细菌蓝细菌蓝细菌，它含有叶绿，它含有叶绿，它含有叶绿
20、，它含有叶绿素素素素a(a(缺乏叶绿素缺乏叶绿素缺乏叶绿素缺乏叶绿素b)b)和藻胆素，具有光合系统和藻胆素，具有光合系统和藻胆素，具有光合系统和藻胆素，具有光合系统 (PS)(PS)和光合系统和光合系统和光合系统和光合系统(PS)(PS)、能进行光合作用，、能进行光合作用，、能进行光合作用，、能进行光合作用，但它又但它又但它又但它又具有具有具有具有细菌细菌细菌细菌的特征，无细胞核及双层膜的特征，无细胞核及双层膜的特征，无细胞核及双层膜的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的结构的细胞器，染色体裸露
21、，是一种典型的原核生物。原核生物。原核生物。原核生物。（三）蓝细菌（蓝藻）（三）蓝细菌（蓝藻）严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物微生物和和植物植物的优点，具体表现在：的优点，具体表现在：1.基因组为原核型，除了裸露的染色体基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含外，不含叶绿体叶绿体DNA和线粒体和线粒体DNA，遗传背景简单，遗传背景简单，便于基便于基因操作和外源因操作和外源DNA的检测。的检测。2.细胞壁属细胞壁属G-，主要由肽聚糖组成，便于
22、外源，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的的转化。转化。3.营光合自养生长，培养条件简单，只需光、营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物微生物和和植物植物的优点，具体表现在：的优点，具体表现在：4.多种蓝藻多种蓝藻含内源质粒含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。供了极好的条件。5.富含蛋白质富含蛋白
23、质，并且多数蓝藻，并且多数蓝藻无毒无毒，早已用作食，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。添花的效果。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。二、真核生物细胞二、真核生物细胞（一）真菌受体细胞（一）真菌受体细胞真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真核生控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特
24、征，因此利用真菌细胞表达高等动植物物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。酵母受体细胞酵母受体细胞 *结构简单、遗传背景比较清楚，遗传操作相对结构简单、遗传背景比较清楚，遗传操作相对 比较简单。比较简单。*具有真核生物蛋白翻译后加工和修饰系统。具有真核生物蛋白翻译后加工和修饰系统。*不含特异性病毒和毒素，对人类安全。不含特异性病毒和毒素，对人类安全。*培养条件简单，可进行大规模发酵，成本低廉。培养条件简单，可进行
25、大规模发酵，成本低廉。*能将表达产物分泌到细胞外，便于产物的提取和能将表达产物分泌到细胞外，便于产物的提取和 加工。加工。单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统优点：优点：严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。*构建基因组文库 *表达外源基因 酵母受体细胞酵母受体细胞应用应用（二）（二）植物受体细胞植物受体细胞*具有体细胞全能性，一个分离的活细胞在合具有体细胞全能性，一个分离的活细胞在合具有体细胞全能性，一个分离的活细胞在合具有体细胞全能性，一个分离的活细胞在合 适的
26、条件下可分化成植株适的条件下可分化成植株适的条件下可分化成植株适的条件下可分化成植株*具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理获得具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理获得具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理获得具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理获得 原生质体原生质体原生质体原生质体.优点：优点：严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（二）（二）植物受体细胞植物受体细胞缺点：缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组不利于摄取重组DNADNA分子。分子。水稻、棉花、玉米、马铃薯、
27、烟草等经济水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。作物和拟南芥等模式植物。现在用作转基因受体的植物有现在用作转基因受体的植物有（三）（三）动物受体细胞动物受体细胞转基因羊，鼠，兔，猪，牛等转基因羊，鼠，兔，猪，牛等动物受体细胞的特点动物受体细胞的特点*体细胞体细胞一般一般无全能性无全能性，只能分化到细胞株，只能分化到细胞株*生殖细胞、胚胎细胞生殖细胞、胚胎细胞等具有全能性，可分等具有全能性，可分 化、培养成转基因动物。化、培养成转基因动物。应用应用严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。优点：优点：（二
28、）（二）动物受体细胞动物受体细胞1.1.能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的加工成熟的mRNAmRNA。2.2.真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的约为酵母细胞的16162020倍。倍。3.3.易被重组易被重组DNADNA质粒转染，具有遗传稳定性和质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。可重复性。4.4.经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。基中
29、，便于提纯和加工，成本低。（三）（三）动物受体细胞动物受体细胞缺点：缺点：组织培养技术要求高，难度较大。组织培养技术要求高，难度较大。常用的动物受体细胞有小鼠常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、细胞、Hele细胞、细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。等。目前用作基因转移的受体动物目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因
30、治疗等。传改良及人类疾病的基因治疗等。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。第二节 重组体导入受体细胞一、重组一、重组DNA导入方式导入方式（一）转化（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（三）转染（三）转染（transfection）受体菌直接捕获受体菌直接捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。（二）转导（二）转导（transduction）借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章
31、制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（一）转化（一）转化（transformation）转化现象最早是由转化现象最早是由Griffith于于1928年在肺炎双球年在肺炎双球菌中发现的。菌中发现的。转化转化：重组质粒：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。的过程称之为转化。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制
32、止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。n n是受体菌直接吸收来自供体菌的是受体菌直接吸收来自供体菌的游离游离DNADNA片片段段，即转化因子，并在细胞中通过，即转化因子，并在细胞中通过遗传交遗传交换换将之组合到自身的基因组中，从而获得将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。供体菌的相应遗传性状的过程。细菌转化的本质细菌转化的本质严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。转化方式转化方式1、热激法（、热激法（heat shock）2、电转化法（、电转化法（electronporation）3、PEG介导的
33、原生质体转化介导的原生质体转化4、接合转化、接合转化严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。制备感受态细胞制备感受态细胞增加受体菌细胞膜的通增加受体菌细胞膜的通透性透性1、热激法、热激法 目的目的感受态细胞：感受态细胞：处于能处于能吸吸收外源收外源DNA分子分子的生理的生理状态的细胞状态的细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。制备感受态细胞制备感受态细胞1、将将处处于于对对数数生生长长期期的的细细菌菌置置于于0的的CaCl2低低渗渗溶溶液液中中，
34、细细胞胞膨膨胀胀成成球球形形，细细胞胞壁壁通通透透性性增增强强，处处于于感感受态；受态；2、将将感感受受态态细细胞胞与与DNA混混合合，Ca2+与与DNA结结合合形形成成抗抗DNase的羟基的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；3、经、经42短时间热激处理，细胞吸收短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；复合物；4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。CaCl2法制备感受态细胞转化法制备感受态细胞转化DNA的原理的原理 严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各
35、类违纪行为或突发事件。10ng载体载体DNA100 L感受态细胞感受态细胞冰浴冰浴30min42 12min加入加入1mL LB培养基培养基（Amp-）37振荡培养振荡培养1h10-100 L转化转化液涂液涂Amp平板平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA转化的基本操作步骤转化的基本操作步骤严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。n n该法重复性好，操作简便快捷，适用于成批制备该法重复性好，操作简便快捷，适用于成批制备
36、该法重复性好，操作简便快捷，适用于成批制备该法重复性好，操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每gggg质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA可以获得可以获得可以获得可以获得101010106 6 6 6l0l0l0l08 8 8 8个转化个转化个转化个转化菌落，完全可以菌落，完全可以菌落，完全可以菌落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要。满足质粒的常规克隆的需要。满足质粒的常规克隆的需要。满足质粒的常规克隆的需要。优点：优点：严格执行突发事件上报
37、制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。2、电转化法、电转化法原原原原理理理理：在在在在高高高高压压压压脉脉脉脉冲冲冲冲下下下下，细细细细菌菌菌菌细细细细胞胞胞胞表表表表面面面面形形形形成成成成暂暂暂暂时时时时性性性性微微微微孔孔孔孔，形形形形成成成成可可可可逆逆逆逆的的的的瞬瞬瞬瞬间间间间通通通通道道道道，重重重重组组组组DNADNA通通通通过过过过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。电电穿穿法法孔孔转转化化法法须须在
38、在低低温温下下（04）进进行行，转化效率要比在室温下操作提高约转化效率要比在室温下操作提高约100倍倍。n n电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源外源外源外源DNADNA浓度等参数的影响。通过优化这些参数，浓度等参数的影响。通过优化这些参数，浓度等参数的影响。通过优化这些参数，浓度等参数的影响。通过优化这些参数，每每每每 gDNAgDNA可以得到可以得到可以得到可以得到10109 9-10-101010转化子。转化子。转化子。转化子。严格执行突发事件上报制度、
39、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（2）电转化法）电转化法原原理理：在在高高压压脉脉冲冲下下，细细菌菌细细胞胞表表面面形形成成暂暂时时性性微微孔孔，重重组组DNADNA通通过过微微孔孔进进入入细细胞胞后后，脉脉冲冲结束，细胞恢复原状。结束，细胞恢复原状。实验简单，实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞不需要制备特殊的感受态细胞“感感受受态态”：清清洗洗处处理理，在在低低温温下下使使细细胞胞处处于于无无离离子子区区且且有有甘甘油油或或蔗蔗糖糖等等保保护护剂剂的的悬悬液液中中，保保证电击过程中细胞不被击穿而死亡。证电击过程中细胞不被击穿而死亡。转化
40、率：转化率：1091010/g DNA严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。n n用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备制备制备制备容易得多容易得多容易得多容易得多。n n当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强用低盐缓冲
41、液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用度，并用度，并用度，并用1010甘油重悬细胞，使其细胞浓度为甘油重悬细胞，使其细胞浓度为甘油重悬细胞，使其细胞浓度为甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3 3l0l01010个个个个m1m1。分装，在干冰上速冻后置于。分装，在干冰上速冻后置于。分装，在干冰上速冻后置于。分装，在干冰上速冻后置于-70-70贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达有
42、效期达有效期达有效期达6 6个月以上。个月以上。个月以上。个月以上。细胞处理细胞处理严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。扩培受体菌扩培受体菌冰浴冰浴，离心集菌离心集菌冰冷的冰冷的水水重悬菌体重悬菌体2离心离心集菌集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体冰冷的水冰冷的水重悬重悬菌体菌体分装分装 电转仪调为电转仪调为2.5kV 25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 质粒质粒DNA 混合混合SOC培养液培养液3
43、7 中速中速震荡震荡涂板涂板转化转化电穿孔转化法操作过程电穿孔转化法操作过程2离心集菌离心集菌严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（二）（二）转导转导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每每 g DNA能形成能形成106个噬菌斑个噬菌斑 转导转导(transduction)：是指通过是指通过噬菌体噬菌体(病毒病毒)颗颗粒感染宿主细胞的途径把外源粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转
44、移到受分子转移到受体细胞内的过程。体细胞内的过程。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（三）（三）转染转染噬菌体噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。受态细胞捕获的过程。现在把现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染转移至动物细胞的过程也称转染转染转染（transfection）采用与质粒采用与质粒DNA转化受体细胞转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组噬菌体成感受态细菌，
45、再将重组噬菌体DNA直接导入受体直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制可以同样复制和繁殖，这种方式称为和繁殖，这种方式称为转染。转染。转染是转化的一种特殊形式，与转化无本质区别转染是转化的一种特殊形式，与转化无本质区别严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。体体外外包包装装过过程程 严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。二、重组二、重组DNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞（
46、二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。1.原生质体转化原生质体转化2.碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化3.PEG1000转化法转化法4.电击法电击法（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。1.利用原生质体进行转化利用原生质体进行转化 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的载体插入外
47、源基因的载体共转化：共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法转转化化转化细胞达原生质体总数的转化细胞达原生质体总数的1%2%，转化率受再生，转化率受再生率影响率影响共转化的原生质体占转化子总数的共转化的原生质体占转化子总数的25%33%严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理感受态感受态2.2.碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体插入外源基因
48、的载体40%PEG 4000热激热激涂布选择性平板，筛选转化子涂布选择性平板，筛选转化子 吸收线性吸收线性DNA能力明显大于环状能力明显大于环状DNA，两者相差，两者相差80倍倍转化率：转化率：103个个/g DNA；共转化现象极少；共转化现象极少严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。4.4.电击转化电击转化电击转化电击转化（1）适于原生质体和完整细胞）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，）转化率高，105个个/g DNA（3）单链转化率高于双链）单链转化率高于双链3.PEG10003.PEG1000转化转化转化转化P
49、EG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化转化严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。二、重组二、重组DNA导入真核细胞导入真核细胞1.1.载体介导的转化（农杆菌介导）载体介导的转化（农杆菌介导）2.2.DNADNA直接导入（基因抢法、电击法等）直接导入（基因抢法、电击法等）3.3.种质系统法（花粉管通道法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（二）
50、导入植物细胞（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法质粒遗传转化方法农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，对绝大多数单子叶植物无侵染植物，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。能力。严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法质粒遗传转化方法将目的基因插入到将目的基因插入到载体的载体的T-DNA区，区，形成重组形成重组DNA严格执