《育苗新技术》PPT课件.ppt

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1、第6单元 园林苗圃育苗新技术主要内容6.1 组织培养技术组织培养技术6.2 容器育苗技术容器育苗技术6.3 无土栽培技术无土栽培技术学习目标理论知识：植物组织培养、容器育苗及无土栽培的概念、特点、分类、发展特点及应用范围等。一般技能：容器育苗中培养基质的原料来源和培养基质的配方、配制方法；无土栽培的条件和无土栽培技术。关键技能：组织培养技术操作；容器育苗的播种技术。6.1 组织培养技术了解植物组织培养的概念、特点、分类、应用范围；掌握植物组织培养的条件、组织培养技术。内 容组织培养概述 植物组织培养的条件 组织培养技术 组织培养概述概念概念 是把植物的部分器官、组织、细胞以及原生质体等，在无菌

2、和人工控制的条件下，接种到培养基上，使之形成完整植株的繁殖方法。理论基础理论基础 植物细胞全能性。n n特点特点n n分类分类 n n应用应用植物组织培养的特点植物组织培养的特点优点优点优点优点n n繁殖系数大。半年内可由一株苗木繁殖一百万株新个体。繁殖系数大。半年内可由一株苗木繁殖一百万株新个体。n n解决常规育苗困难的问题。解决常规育苗困难的问题。n n培育脱毒苗。培养茎尖分生组织（培育脱毒苗。培养茎尖分生组织（0.20.20.3 mm0.3 mm）,可以脱掉病毒，可以脱掉病毒，育出无病毒苗（又称脱毒苗）。脱毒苗抗逆性强、质优、生长旺盛。育出无病毒苗（又称脱毒苗）。脱毒苗抗逆性强、质优、生

3、长旺盛。n n不受季节限制。一年四季均可进行，可实现工厂化育苗。不受季节限制。一年四季均可进行，可实现工厂化育苗。n n利于种质资源的保存。利于种质资源的保存。缺点缺点缺点缺点n n需要一定的设备条件，技术要求较高，操作人员需要专门的培训。需要一定的设备条件，技术要求较高，操作人员需要专门的培训。n n试验阶段成本较高。试验阶段成本较高。植物组织培养的分类植物组织培养的分类l依据用做外植体的植物材料的不同来划分l植株培养植株培养 器官培养器官培养胚胎培养胚胎培养依据用做外植体的植物材料的不同来划分组织培养组织培养组织培养组织培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养 原生质体培养原生质体培养原生质体

4、培养原生质体培养依据用做外植体的植物材料的不同来划分组织培养组织培养组织培养组织培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养 原生质体培养原生质体培养原生质体培养原生质体培养依据所用的培养基不同来划分依据所用的培养基不同来划分固体培养固体培养液体培养液体培养植物组织培养的应用无性系的快繁无性系的快繁无性系的快繁无性系的快繁 对于不能用普通繁殖法或用普通繁对于不能用普通繁殖法或用普通繁殖法繁殖太慢的植物，如兰科植物、蕨类植物和许殖法繁殖太慢的植物，如兰科植物、蕨类植物和许多观叶植物，组织培养技术是实现商品化生产的最多观叶植物，组织培养技术是实现商品化生产的最佳途径。同时，对于新育成、新引进品种、稀缺品佳

5、途径。同时，对于新育成、新引进品种、稀缺品种、濒危植物和优良单株等可扩大繁殖。一个新育种、濒危植物和优良单株等可扩大繁殖。一个新育成品种问世后，可在两三年内迅速推广。成品种问世后，可在两三年内迅速推广。脱毒苗培育脱毒苗培育脱毒苗培育脱毒苗培育 利用植物茎尖上病毒分布少甚至没有利用植物茎尖上病毒分布少甚至没有的特点，进行培养、增殖。使用无病毒种苗，可以的特点，进行培养、增殖。使用无病毒种苗，可以减少直至杜绝病毒病的传播。减少直至杜绝病毒病的传播。植物组织培养的条件植物组织培养的生产设施植物组织培养的生产设施 n n实验室实验室 n n主要仪器设备及器材主要仪器设备及器材培养基培养基n n培养基的

6、基本组成培养基的基本组成 组织培养的培养基种类较多，但都组织培养的培养基种类较多，但都包括无机营养、有机成分、碳素、琼脂、生长调节剂、包括无机营养、有机成分、碳素、琼脂、生长调节剂、水等。水等。n nMSMS培养基（培养基（MurashigeMurashige和和SkoogSkoog，19621962年）年）n n其他常用培养基其他常用培养基 环境条件环境条件 实验室准备室准备室准备室准备室 用以进行组培时所需器具的洗涤、干燥、用以进行组培时所需器具的洗涤、干燥、保存；蒸馏水的制备；培养基的配制、分装、包扎保存；蒸馏水的制备；培养基的配制、分装、包扎和高压消毒；处理大型植物材料，以及进行生理、

7、和高压消毒；处理大型植物材料，以及进行生理、生化的分析等各种操作。其要求与一般化学实验室生化的分析等各种操作。其要求与一般化学实验室相同。相同。接种室（无菌室）接种室（无菌室）接种室（无菌室）接种室（无菌室）要求室内干爽、安静，清洁明要求室内干爽、安静，清洁明亮，保持良好的无菌和低密度有菌状态。主要用于亮，保持良好的无菌和低密度有菌状态。主要用于培养材料的表面消毒、外植体的接种、无菌材料的培养材料的表面消毒、外植体的接种、无菌材料的继代转接等。继代转接等。培养室培养室培养室培养室 要求室内洁净、干燥。是进行初代、继代、要求室内洁净、干燥。是进行初代、继代、生根培养的场所。生根培养的场所。主要仪

8、器设备及器材主要仪器设备及器材准备室的仪器设备与器材天平天平 、酸度计、蒸馏水器冰箱酸度计、蒸馏水器冰箱、烘箱烘箱准备室的仪器设备与器材高压灭菌锅、水槽高压灭菌锅、水槽、实验台实验台、药品柜药品柜、药药品柜品柜、玻璃器皿玻璃器皿 无菌室仪器设备与器材超净工作台、双目实体解剖镜超净工作台、双目实体解剖镜、细菌过滤细菌过滤器、细菌滤膜器、细菌滤膜、接种工具接种工具 纯水机与蒸纯水机与蒸馏水发生器：馏水发生器：显微镜包括解剖镜，生物显微镜，倒置显微镜等。如茎尖的分离则需要解借助解剖镜。酸度计酸度计：用于校正培养基和酶制剂的PH。电炉电炉推车推车酒精灯酒精灯封口膜封口膜接种器具接种器具灭菌器灭菌器培养

9、瓶培养瓶培养室仪器设备与器材培养室仪器设备与器材 空调空调定时器定时器增湿机和除湿机增湿机和除湿机 培养架培养架 光照培养箱光照培养箱摇床或旋转床摇床或旋转床 日光灯日光灯培养基的基本组成培养基的基本组成无机营养无机营养n n大量元素大量元素大量元素大量元素 一般指浓度大于一般指浓度大于0.5 mmol/L0.5 mmol/L，包括，包括C C、H H、OO、N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S等。它们是植物等。它们是植物细胞中合成核酸、蛋白质、酶系、叶绿素等必不细胞中合成核酸、蛋白质、酶系、叶绿素等必不可少的营养元素。可少的营养元素。n n微量元素微量元素微量元素微量元素 包括

10、包括FeFe、CuCu、MoMo、NaNa、ZnZn、MnMn、B B、CoCo等。它们在植物的生命活动中，多以辅基等。它们在植物的生命活动中，多以辅基形式在酶系中起着重要的作用。在培养基中添加形式在酶系中起着重要的作用。在培养基中添加10107 710105 mmol/L5 mmol/L即可满足需要。即可满足需要。有机成分有机成分n n维生素维生素维生素维生素 主要有维生素主要有维生素B B1 1(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、维生、维生素素B B3 3(烟酸烟酸)、维生素、维生素B B6 6(盐酸吡哆素盐酸吡哆素)、生物素、生物素、叶酸等。它们以辅酶的形式参与酶系的活动及细叶酸等。它们以辅酶的形

11、式参与酶系的活动及细胞蛋白质、脂肪、糖代谢等重要的生理活动。胞蛋白质、脂肪、糖代谢等重要的生理活动。n n氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸 主要有甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪主要有甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等。它们能促进不定芽、胚状体氨酸、谷氨酰胺等。它们能促进不定芽、胚状体的分化。的分化。n n肌醇肌醇肌醇肌醇 利于活性物质发挥作用并参与糖代谢，利于活性物质发挥作用并参与糖代谢，能促进培养物快速生长。能促进培养物快速生长。植物生长调节剂植物生长调节剂植物生长调节剂植物生长调节剂 常用的主要有三大类：细胞分裂常用的主要有三大类：细胞分裂素类、生长素类、赤霉素类。对不定芽、胚状体、素类、生长

12、素类、赤霉素类。对不定芽、胚状体、不定根等起重要作用。不定根等起重要作用。n n细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类 包括激动素（包括激动素（KTKT）、玉米素（）、玉米素（ZTZT）、）、6-6-苄基氨基嘌呤（苄基氨基嘌呤（6-BA6-BA）等。其作用强弱依次是）等。其作用强弱依次是ZTZTBABAKTKT。具有促进细胞分裂、延缓组织衰老、诱导不定。具有促进细胞分裂、延缓组织衰老、诱导不定芽分化等作用。芽分化等作用。n n生长素类生长素类生长素类生长素类 包括萘乙酸（包括萘乙酸（NAANAA）、吲哚乙酸（）、吲哚乙酸（IAAIAA）、）、吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBAIBA）、）、2

13、 2，4 4D D等。其作用强弱依次是等。其作用强弱依次是2 2，4 4D DNAANAAIBAIBAIAAIAA。它们能促进不定根分化，低浓。它们能促进不定根分化，低浓度度2 2，4 4D D有利于胚状体的分化。有利于胚状体的分化。n n赤霉素类赤霉素类赤霉素类赤霉素类 通常使用赤霉酸（通常使用赤霉酸（GAGA3 3）。它能促进已分化）。它能促进已分化芽的伸长，但不利于不定芽、不定根的分化。芽的伸长，但不利于不定芽、不定根的分化。糖糖糖糖 最好的是蔗糖，其次是葡萄糖和果糖。是不可最好的是蔗糖，其次是葡萄糖和果糖。是不可缺少的碳源和能源，还可维持一定的渗透压。愈伤缺少的碳源和能源，还可维持一定

14、的渗透压。愈伤组织与不定芽诱导最适的蔗糖浓度为组织与不定芽诱导最适的蔗糖浓度为3 3。琼脂琼脂琼脂琼脂 从海藻中提取，主要组分为无取代的琼脂糖，从海藻中提取，主要组分为无取代的琼脂糖，其本身没有任何营养成分，遇热液化，在常温下固其本身没有任何营养成分，遇热液化，在常温下固化，其无毒、无味、化学性质稳定，且可使培养基化，其无毒、无味、化学性质稳定，且可使培养基中各种可溶性物质均匀地扩散分布。一般用量为中各种可溶性物质均匀地扩散分布。一般用量为7 7，培养基偏酸时其用量酌情增加。加热时间过长，环培养基偏酸时其用量酌情增加。加热时间过长，环境温度过高均会影响固化。境温度过高均会影响固化。水水水水 科

15、研工作中宜选用蒸馏水或饮用纯净水。工厂科研工作中宜选用蒸馏水或饮用纯净水。工厂化大量生产时，可就近选择水质软、清洁、无毒害化大量生产时，可就近选择水质软、清洁、无毒害的水源。的水源。其他其他 n n天然生长促进物质天然生长促进物质天然生长促进物质天然生长促进物质 主要有麦芽提取液、酵母主要有麦芽提取液、酵母提取液、黄瓜汁、番茄汁、椰子汁、柑桔汁等。提取液、黄瓜汁、番茄汁、椰子汁、柑桔汁等。用于离体胚珠和胚培养。用于离体胚珠和胚培养。n n活性炭活性炭活性炭活性炭 吸附非极性物质和色素等大分子。通吸附非极性物质和色素等大分子。通常使用浓度为常使用浓度为0.50.510 g/L10 g/L。对防止

16、褐变有较为。对防止褐变有较为明显的效果。明显的效果。n n防止褐变的添加剂防止褐变的添加剂防止褐变的添加剂防止褐变的添加剂 常用的防止褐变的氧化试常用的防止褐变的氧化试剂有抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐剂有抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐等等。MS培养基的主要成分表（单位：mg/L）环境条件 温度温度温度温度 通常培养物温度应控制在通常培养物温度应控制在252252范围内。范围内。光照光照光照光照 在茎尖的起始培养及试管苗继代培养阶段光在茎尖的起始培养及试管苗继代培养阶段光照强度为照强度为100010003000lx3000lx，生根和小植株阶段以，生根和小植株阶段以300030

17、0010000lx10000lx为宜。每日光照时间为宜。每日光照时间121216h16h。通常用日。通常用日光灯作为光源。光灯作为光源。气体气体气体气体 培养物产生的乙烯、培养物产生的乙烯、COCO2 2、乙醇等气体会影、乙醇等气体会影响其生长和分化。采用能透气的封口膜为培养瓶封响其生长和分化。采用能透气的封口膜为培养瓶封口，利于瓶内气体与外界的交换。口，利于瓶内气体与外界的交换。组织培养技术组织培养技术 培养基制备技术培养基制备技术n n准备工作准备工作n n母液配制母液配制n n培养基配制培养基配制培养基保存培养基保存外植体获取与消毒外植体获取与消毒接种接种培养培养杂菌污染的识别及其预防杂

18、菌污染的识别及其预防外植体的褐变及玻璃化现象外植体的褐变及玻璃化现象 准备工作玻璃器皿的洗涤是组培中很重要的准备工作。洗涤的质量对组培的结果有很大影响。清洗程序一般为：清水冲洗洗洁精水刷洗清水冲洗用蒸馏水冲12次晾干或烘干备用。洗涤后的玻璃器皿空置时间不要过长，最好不超过2周。母液配制使用的主要仪器、器具母液配制使用的主要仪器、器具此外，还有药匙、玻璃棒、蒸馏水瓶等物品。此外，还有药匙、玻璃棒、蒸馏水瓶等物品。此外，还有药匙、玻璃棒、蒸馏水瓶等物品。此外，还有药匙、玻璃棒、蒸馏水瓶等物品。母液配制母液配制 MS MS培养基母液配制方法培养基母液配制方法将基本培养基按表配制成母液，放在冰箱中保存

19、，用时按需要稀释。配母液用的水采用蒸馏水或去离子水。MSMS培养基母液配制方法培养基母液配制方法培养基母液配制方法培养基母液配制方法生长调节剂母液配制生长调节剂母液配制 通常配成通常配成1mg/ml1mg/ml的母液，这样的浓度即便于计算的母液，这样的浓度即便于计算所需量，也可避免冷藏时结晶的析出。所需量，也可避免冷藏时结晶的析出。n n生长素类母液生长素类母液生长素类母液生长素类母液 称取称取100mg100mg吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAAIAA）或吲哚丁）或吲哚丁酸（酸（IBAIBA）、萘乙酸（）、萘乙酸（NAANAA）等，放入）等，放入100ml100ml的烧杯里，的烧杯里，用数滴浓度为用

20、数滴浓度为1molNaOH1molNaOH溶液使之溶解，加少量水，待溶液使之溶解，加少量水，待完全溶解后倒入完全溶解后倒入100ml100ml容量瓶中，用水涮洗烧杯数次，容量瓶中，用水涮洗烧杯数次，涮洗液也倒入涮洗液也倒入100ml100ml容量瓶中，最后定容至刻度。反复容量瓶中，最后定容至刻度。反复摇动容量瓶，均匀后倒至棕色试剂瓶内，贴上标签存放摇动容量瓶，均匀后倒至棕色试剂瓶内，贴上标签存放在冰箱中。在冰箱中。n n细胞分裂素类母液细胞分裂素类母液细胞分裂素类母液细胞分裂素类母液 方法与其上大致相同，所不同之处方法与其上大致相同，所不同之处为用为用0.10.11molHCl1molHCl溶

21、解，再加水定容。溶解，再加水定容。n n赤霉素类母液赤霉素类母液赤霉素类母液赤霉素类母液 称取称取100mg100mg赤霉素，用赤霉素，用95%95%酒精溶解并酒精溶解并加水定容至加水定容至100ml100ml。MSMS培养基母液配制所用的仪器设备、器具培养基母液配制所用的仪器设备、器具还有天平、烧杯、滴瓶、还有天平、烧杯、滴瓶、电炉、玻璃棒、精密电炉、玻璃棒、精密PH试纸。试纸。6010便携式酸碱度计 MSMS培养基分装所用的仪器设备、器具培养基分装所用的仪器设备、器具培养基分装所用的仪器设备、器具培养基分装所用的仪器设备、器具 锥形瓶锥形瓶锥形瓶锥形瓶 分液漏斗架分液漏斗架分液漏斗架分液漏

22、斗架灭菌器、搪瓷盘、手套MS培养基灭菌所用的仪器设备、器具不不锈钢立式立式灭菌器菌器培养基配制溶解琼脂和蔗糖溶解琼脂和蔗糖溶解琼脂和蔗糖溶解琼脂和蔗糖 在在1000ml1000ml的烧杯中加入的烧杯中加入600600700ml700ml纯纯净水，将称好的净水，将称好的6 68g8g琼脂放进烧杯中加热煮溶后，加入琼脂放进烧杯中加热煮溶后，加入30 30 g g蔗糖，搅拌溶解。蔗糖，搅拌溶解。加入母液加入母液加入母液加入母液 将母液将母液、，按表中每配，按表中每配1 L1 L培养基取母液所需量，分别加入到烧杯中，加水定容至培养基取母液所需量，分别加入到烧杯中，加水定容至1000ml1000ml。调

23、节调节调节调节pHpH值值值值 搅拌后静止，用酸度计或搅拌后静止，用酸度计或pHpH精密试纸测定精密试纸测定pHpH值，以值，以1molNaOH1molNaOH或或1molHCl1molHCl将将pHpH值调至值调至5.85.8。培养基封装培养基封装培养基封装培养基封装 用漏斗将培养基分装到培养瓶中，注入量约用漏斗将培养基分装到培养瓶中，注入量约为瓶容积的为瓶容积的1/41/4。分装动作要快。培养基冷却前应灌装完毕，。分装动作要快。培养基冷却前应灌装完毕，且尽可能避免培养基粘在瓶壁上。且尽可能避免培养基粘在瓶壁上。培养基配制培养瓶封口培养瓶封口培养瓶封口培养瓶封口 用塑料封口膜、塑料瓶盖等将瓶

24、口封严。用塑料封口膜、塑料瓶盖等将瓶口封严。培养基消毒培养基消毒培养基消毒培养基消毒 将包扎密封好的培养瓶放在高压蒸气灭菌锅将包扎密封好的培养瓶放在高压蒸气灭菌锅中灭菌，在温度为中灭菌，在温度为121 121，压力，压力107.9 kPa107.9 kPa下维持下维持151520 20 minmin。待压力自然下降到零时，开启放气阀，打开锅盖，取。待压力自然下降到零时，开启放气阀，打开锅盖，取出后在干净柜中存放。灭菌时应注意在稳压前一定要将灭菌出后在干净柜中存放。灭菌时应注意在稳压前一定要将灭菌锅内的冷空气排除干净，否则达不到灭菌的效果。其次是灭锅内的冷空气排除干净，否则达不到灭菌的效果。其次

25、是灭菌的时间不宜过长，温度要严格控制在菌的时间不宜过长，温度要严格控制在121 121。过高的温度。过高的温度与过长的灭菌时间，会引起蔗糖降解，在磷酸盐的作用下，与过长的灭菌时间，会引起蔗糖降解，在磷酸盐的作用下，促使葡萄糖转化为酮糖及其他产物，磷酸盐与铁结合而沉淀，促使葡萄糖转化为酮糖及其他产物，磷酸盐与铁结合而沉淀，玻璃中的可溶性物质释放到培养基中等。玻璃中的可溶性物质释放到培养基中等。培养基配制培养基配制 植物生长调节剂等不耐热物质的过滤消毒植物生长调节剂等不耐热物质的过滤消毒 过滤消毒需在无菌室或超净工作台上进行。易受高温破坏的过滤消毒需在无菌室或超净工作台上进行。易受高温破坏的IAA

26、IAA、IBAIBA、ZTZT、尿素、某些维生素等培养基组分可过滤消、尿素、某些维生素等培养基组分可过滤消毒后加入高温高压消毒过的培养基中。过滤消毒可用细菌过毒后加入高温高压消毒过的培养基中。过滤消毒可用细菌过滤器。防细菌滤膜孔径直径小于滤器。防细菌滤膜孔径直径小于0.45m0.45m，溶液通过滤膜时，溶液通过滤膜时，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。在经高温高压灭菌的培养基中加入不耐热物在经高温高压灭菌的培养基中加入不耐热物质质 在无菌场所进行。若为固体培养基，当其冷却至在无菌场所进行。若为固体培养基，当其冷却至40 40 左右，琼脂将要凝结之前

27、，加入经过滤消毒的各项不耐热成左右，琼脂将要凝结之前，加入经过滤消毒的各项不耐热成分，然后混匀放置，待冷凉备用。在培养瓶数量很大的情况分，然后混匀放置，待冷凉备用。在培养瓶数量很大的情况下，这一操作往往很麻烦。若为液体培养基，可在冷却到室下，这一操作往往很麻烦。若为液体培养基，可在冷却到室温后再立即加入。温后再立即加入。培养基保存培养基从高压灭菌锅中取出后，应立即平放在平整的桌面培养基从高压灭菌锅中取出后，应立即平放在平整的桌面培养基从高压灭菌锅中取出后，应立即平放在平整的桌面培养基从高压灭菌锅中取出后，应立即平放在平整的桌面或斜面架上，甚至培养基冷却凝固后再将它们转移。已经配或斜面架上，甚至

28、培养基冷却凝固后再将它们转移。已经配或斜面架上，甚至培养基冷却凝固后再将它们转移。已经配或斜面架上，甚至培养基冷却凝固后再将它们转移。已经配制好的培养基最好经过制好的培养基最好经过制好的培养基最好经过制好的培养基最好经过3 d3 d的预培养，防止灭菌不彻底的培的预培养，防止灭菌不彻底的培的预培养，防止灭菌不彻底的培的预培养，防止灭菌不彻底的培养基在接种后被菌类污染而造成不必要的损失。养基在接种后被菌类污染而造成不必要的损失。养基在接种后被菌类污染而造成不必要的损失。养基在接种后被菌类污染而造成不必要的损失。n n防尘防尘防尘防尘 对于中小规模的生产者来说，通常将培养基存放对于中小规模的生产者来

29、说，通常将培养基存放于普通的房间里，此时要特别注意防尘工作，且在使用于普通的房间里，此时要特别注意防尘工作，且在使用前要进行表面消毒。前要进行表面消毒。n n避光避光避光避光 备用的培养基应贮藏于暗处，特别是在备用的培养基应贮藏于暗处，特别是在培养基中含有易于光解的吲哚乙酸等物质时更要培养基中含有易于光解的吲哚乙酸等物质时更要注意。此外，在光照条件下，培养基的某些添加注意。此外，在光照条件下，培养基的某些添加成分如椰乳会发生变化，不能达到预期的培养效成分如椰乳会发生变化，不能达到预期的培养效果果n n恒温恒温恒温恒温 当培养基冷却后，可于当培养基冷却后，可于4 4左右的温度条件下贮左右的温度条

30、件下贮藏藏3 36 6周。在贮藏过程中应避免环境温度大幅度的变化。周。在贮藏过程中应避免环境温度大幅度的变化。因气温骤升或骤降会使培养容器内的空气随之热胀冷缩，因气温骤升或骤降会使培养容器内的空气随之热胀冷缩，加大菌类进入培养基的机会。加大菌类进入培养基的机会。n n定期更新定期更新定期更新定期更新 由于培养基的水分散失、某些培养基成分由于培养基的水分散失、某些培养基成分的光解变质的必然性，因此即使所贮存的培养基从外观的光解变质的必然性，因此即使所贮存的培养基从外观上看不出什么变化，也必须定期更新，不宜长期贮藏。上看不出什么变化，也必须定期更新，不宜长期贮藏。外植体获取与消毒从田间采回的准备接

31、种用的材料称为外植体。对外植体进从田间采回的准备接种用的材料称为外植体。对外植体进行表面消毒获得无菌材料，是组织培养成功与否的重要环节。行表面消毒获得无菌材料，是组织培养成功与否的重要环节。组织培养所选用的外植体，可为植物的茎尖、侧芽、叶片、组织培养所选用的外植体，可为植物的茎尖、侧芽、叶片、叶柄、花瓣、花萼、胚轴、鳞茎、根茎、花粉粒、花药等器叶柄、花瓣、花萼、胚轴、鳞茎、根茎、花粉粒、花药等器官。以快繁为主要目的时大多采用茎尖、侧芽等。一般情况官。以快繁为主要目的时大多采用茎尖、侧芽等。一般情况下，生长期较幼嫩的材料茎尖、嫩叶、花蕾等部位更容易分下，生长期较幼嫩的材料茎尖、嫩叶、花蕾等部位更

32、容易分化，培养效果较好。到田间取材时，一般应准备塑料袋、锋化，培养效果较好。到田间取材时，一般应准备塑料袋、锋利的刀剪、标签、笔等。取材时间应选在晴天上午利的刀剪、标签、笔等。取材时间应选在晴天上午1010时左右，时左右，阴雨天不宜。同时应尽量选择离开地表、老嫩适中的材料。阴雨天不宜。同时应尽量选择离开地表、老嫩适中的材料。要从健壮无病的植株上选取外植体。要从健壮无病的植株上选取外植体。从田间植株上采取的外植体比从温室植株采到的外植体更易受感染。如果我们必须从田间植株上采取外植体，最好先把这个植株种在室内的容器内，让其在室内发育新的嫩芽，然后用新发育成的嫩芽进行培养。在室内种植时，采用无土栽培

33、，基质灌溉，保持3638 的温度条件下生长几天或几个月，在这种条件下长出来的新梢不易造成污染。外植体在进行表面消毒前先需预处理。对于从温外植体在进行表面消毒前先需预处理。对于从温室中采集的外植体，可置于烧杯中，放在水笼头下，室中采集的外植体，可置于烧杯中，放在水笼头下，用流动的自来水冲洗用流动的自来水冲洗202060min60min（大田中采集的外（大田中采集的外植体要冲洗植体要冲洗2h2h以上），而后再用无菌水漂洗以上），而后再用无菌水漂洗1 13 3次。次。不同的外植体所采用的消毒方法不同，但仅限于不同的外植体所采用的消毒方法不同，但仅限于材料的表面消毒，对它们内部所携带的病菌、真菌材料的

34、表面消毒，对它们内部所携带的病菌、真菌等有害微生物却效果不佳，因此可考虑在培养基中等有害微生物却效果不佳，因此可考虑在培养基中加入链霉素、青霉素等抗生素来防止培养基的污染。加入链霉素、青霉素等抗生素来防止培养基的污染。经预处理的外植体一般按表的顺序进行消毒。经预处理的外植体一般按表的顺序进行消毒。接种所用的仪器设备、器具接种所用的仪器设备、器具接种所用的仪器设备、器具接种所用的仪器设备、器具超净工作台、酒精灯、超净工作台、酒精灯、超净工作台、酒精灯、超净工作台、酒精灯、镊子、烧杯、火柴（或镊子、烧杯、火柴（或镊子、烧杯、火柴（或镊子、烧杯、火柴（或打火机）、小刀、解剖打火机）、小刀、解剖打火机

35、）、小刀、解剖打火机）、小刀、解剖针等；智能控制系统或针等；智能控制系统或针等；智能控制系统或针等；智能控制系统或温度计、湿度计、空调温度计、湿度计、空调温度计、湿度计、空调温度计、湿度计、空调等。等。等。等。接种接种接种是组织培养过程中易于污染的一个环节，操接种是组织培养过程中易于污染的一个环节，操作过程必须在无菌条件下进行。作过程必须在无菌条件下进行。接种前的准备工作接种前的准备工作接种前的准备工作接种前的准备工作n n每次接种或继代繁殖前，应提前每次接种或继代繁殖前，应提前30min30min打开接种室和超打开接种室和超净工作台上的紫外线灯进行消毒，然后打开超净工作台净工作台上的紫外线灯

36、进行消毒，然后打开超净工作台的风机，吹风的风机，吹风10min10min。n n操作人员进入接种室前，用肥皂和清水将手洗干净，操作人员进入接种室前，用肥皂和清水将手洗干净，换上经过消毒的工作服和拖鞋，并戴上工作帽和口罩。换上经过消毒的工作服和拖鞋，并戴上工作帽和口罩。n n开始接种前，用开始接种前，用70%70%的酒精棉球仔细擦拭手和超净工的酒精棉球仔细擦拭手和超净工作台面。作台面。n n准备一个灭过菌的培养皿或不锈钢盘，内放经过高压准备一个灭过菌的培养皿或不锈钢盘，内放经过高压消毒的滤纸片。解剖刀、医用剪刀、镊子、解剖针等用消毒的滤纸片。解剖刀、医用剪刀、镊子、解剖针等用具应预先浸在具应预先

37、浸在95%95%的酒精溶液内，置于超净工作台的右的酒精溶液内，置于超净工作台的右侧。每个台位至少备侧。每个台位至少备2 2把解剖刀和把解剖刀和2 2把镊子，轮流使用。把镊子，轮流使用。n n接种前先点燃酒精灯，然后将解剖刀、镊子、剪子等接种前先点燃酒精灯，然后将解剖刀、镊子、剪子等在火焰上方灼烧后，晾于架上备用。在火焰上方灼烧后，晾于架上备用。接种技术（接种技术（接种操作）n n用镊子将植物材料夹到已高压消毒、盛有滤纸用镊子将植物材料夹到已高压消毒、盛有滤纸的培养皿中，在超净工作台上将外植体切成的培养皿中，在超净工作台上将外植体切成3 35 5 mmmm的小段，在双筒解剖镜下剥离的茎尖分生组的

38、小段，在双筒解剖镜下剥离的茎尖分生组织大小约为织大小约为0.20.20.3mm0.3mm，经过热处理的材料可，经过热处理的材料可带带2 24 4个叶原基，切生长点长约个叶原基，切生长点长约0.5mm0.5mm。n n将培养瓶倾斜拿住。打开瓶塞前，先在酒精灯将培养瓶倾斜拿住。打开瓶塞前，先在酒精灯火焰上方烤一下瓶口，然后打开瓶塞，并尽快将火焰上方烤一下瓶口，然后打开瓶塞，并尽快将外植体接种到培养基上。注意，材料一定要嵌入外植体接种到培养基上。注意，材料一定要嵌入培养基，而不是放在培养基上面或全部埋入培养培养基，而不是放在培养基上面或全部埋入培养基内。塞住瓶塞以前，再在火焰上方烤一下。基内。塞住瓶

39、塞以前，再在火焰上方烤一下。n n每切一次材料，解剖刀、镊子等都要放回酒精每切一次材料，解剖刀、镊子等都要放回酒精内浸泡，并灼烧。内浸泡，并灼烧。除上述常规操作步骤以外，对于新建的组织培养室首次使用以前，必须进行彻底的擦洗和消毒。先将所有的角落擦洗干净，然后进行薰蒸消毒（即用甲醛和高锰酸钾混合，产生大量蒸气消毒），其后再用紫外线灯照射。培养 1 初代培养初代培养 也称诱导培养。培养基由于植物种类的不同而不同，培养基由于植物种类的不同而不同，通常是通常是MsMs基本培养基加入适量的植物生长调节剂及其他成分。基本培养基加入适量的植物生长调节剂及其他成分。首先在一定温度（首先在一定温度（222228

40、 28）下进行暗培养，待长出愈伤）下进行暗培养，待长出愈伤组织后转入光培养。如对于赤道附近的花卉应在恒温状态下组织后转入光培养。如对于赤道附近的花卉应在恒温状态下培养，而对原产于温带的花卉用变温培养效果更好。此阶段培养，而对原产于温带的花卉用变温培养效果更好。此阶段主要诱导芽体解除休眠，恢复生长。主要诱导芽体解除休眠，恢复生长。培养 2 继代培养继代培养 也称增殖培养。将见光变绿的芽体组织从诱导培养基将见光变绿的芽体组织从诱导培养基转接到芽丛培养基上，在每天光照转接到芽丛培养基上，在每天光照121216 h16 h、光照强度、光照强度100010002000 lx2000 lx条件下培养，不久

41、即产生绿色丛生芽。将芽丛切割条件下培养，不久即产生绿色丛生芽。将芽丛切割分离，进行继代培养，扩大繁殖，平均每月增殖一代，每代分离，进行继代培养，扩大繁殖，平均每月增殖一代，每代增殖增殖5 51010倍。为了防止变异或突变，通常只继代培养倍。为了防止变异或突变，通常只继代培养10101212次。根据需要，一部分进行生根培养，一部分仍继代培养。次。根据需要，一部分进行生根培养，一部分仍继代培养。培养 3 生根培养生根培养 培养基通常为培养基通常为1/2MS1/2MS培养基加入适量的植物生长调节剂，培养基加入适量的植物生长调节剂，如如1/2MS+NAA(1/2MS+NAA(或或IBA)0.1mg/L

42、IBA)0.1mg/L。切取增殖培养瓶中的无根。切取增殖培养瓶中的无根苗，接种到生根培养基上进行诱根培养。有些易生根的植物苗，接种到生根培养基上进行诱根培养。有些易生根的植物在继代培养中通常会产生不定根，可以直接将生根苗移出进在继代培养中通常会产生不定根，可以直接将生根苗移出进行驯化培养。或者将未生根的试管苗长到行驯化培养。或者将未生根的试管苗长到3 34 cm4 cm长时切下长时切下来，直接栽到蛭石为基质苗床中进行瓶外生根，效果也非常来，直接栽到蛭石为基质苗床中进行瓶外生根，效果也非常好，省时省工，降低成本。这个阶段可筛选淘汰生长不良和好，省时省工，降低成本。这个阶段可筛选淘汰生长不良和感病

43、的试管苗。感病的试管苗。培养 4 驯化培养发根的组培苗或称试管苗从培养瓶中移出，在温室中栽培。至植株长发根的组培苗或称试管苗从培养瓶中移出，在温室中栽培。至植株长大发生大发生5 56 6片叶为止的过程为驯化培养阶段，这是组培苗从异养到自养片叶为止的过程为驯化培养阶段，这是组培苗从异养到自养的阶段。的阶段。组培苗移出前要加强培养室的光照强度和延长光照时间，进行光照锻组培苗移出前要加强培养室的光照强度和延长光照时间，进行光照锻炼。一般进行炼。一般进行7 710 d10 d。再打开瓶盖，让试管苗暴露在空气中锻炼。再打开瓶盖，让试管苗暴露在空气中锻炼1 12 d2 d。以适应外界环境条件。以适应外界环

44、境条件。移栽基质最好用透气性强的蛭石、珍珠岩与泥炭。如果栽植在土壤中，移栽基质最好用透气性强的蛭石、珍珠岩与泥炭。如果栽植在土壤中，土壤应为疏松的沙壤土、沙土掺入少量有机质或林地的腐殖质土。用营土壤应为疏松的沙壤土、沙土掺入少量有机质或林地的腐殖质土。用营养钵育苗，可用直径养钵育苗，可用直径6 cm6 cm的塑料营养钵。移栽时选择的塑料营养钵。移栽时选择2 24 cm4 cm、3 34 4片片叶的健壮试管苗，将根部培养基冲洗干净，以避免微生物污染而造成幼叶的健壮试管苗，将根部培养基冲洗干净，以避免微生物污染而造成幼苗根系腐烂。如果是瓶外生根，将植株基部愈伤组织去掉，用水冲洗一苗根系腐烂。如果是

45、瓶外生根，将植株基部愈伤组织去掉，用水冲洗一下，直接插入基质中。移栽后浇透水，加塑料罩或塑料薄膜保湿。下，直接插入基质中。移栽后浇透水，加塑料罩或塑料薄膜保湿。一般炼苗的最初一般炼苗的最初7 d7 d，应保持，应保持9090以上的空气相对湿度，适当遮荫。以上的空气相对湿度，适当遮荫。7 d7 d以后适当通风降低空气相对湿度，温度保持在以后适当通风降低空气相对湿度，温度保持在232328 28。半月后去罩，。半月后去罩，掀膜，每隔掀膜，每隔10 d10 d喷一次稀释喷一次稀释100100倍的倍的MsMs大量元素母液。培养约大量元素母液。培养约4 46 6周后，周后，试管苗便可转入正常管理。试管苗

46、便可转入正常管理。复习思考题接种程序。如何分辨细菌污染和真菌污染，预防方法有哪些？MS培养基及其母液制备程序。怎样减少褐变和玻璃化的发生机率？6.2 容器苗生产技术了解容器育苗的概念、特点、发展情况，工厂化了解容器育苗的概念、特点、发展情况，工厂化育苗的设施构成；育苗的设施构成；掌握容器的种类、简易容器的制作方法；掌握容器的种类、简易容器的制作方法；掌握培养基质的原料来源和培养基质的配方、配掌握培养基质的原料来源和培养基质的配方、配制方法；制方法；掌握容器育苗的方法。掌握容器育苗的方法。容器育苗图内 容容器育苗概述 容器育苗的条件 容器育苗技术 容器育苗的发展 容器育苗概述容器育苗是60年代发

47、展起来的一项育苗技术，我国70年代开始应用。容器育苗是利用各种容器装入培养土或培养基质繁育苗木的方法。所得苗木称为容器苗。与传统育苗方式相比，容器育苗具有如下特点：n n优点优点 n n缺点缺点优点优点苗木出圃栽植不受季节限制苗木出圃栽植不受季节限制 培育容器苗不受土壤条件限制培育容器苗不受土壤条件限制 发芽率高，节约种子发芽率高，节约种子 可缩短育苗年限，育苗工序少可缩短育苗年限，育苗工序少利于培育优质壮苗利于培育优质壮苗利于培育优质壮苗利于培育优质壮苗提高栽植成活率提高栽植成活率提高栽植成活率提高栽植成活率容器育苗与设施栽培的有机结合容器育苗与设施栽培的有机结合容器育苗与设施栽培的有机结合

48、容器育苗与设施栽培的有机结合缺点缺点育苗技术复杂，管理更为精细。育苗技术复杂，管理更为精细。苗木的根系因容器的限制有时会形成畸形根系。苗木的根系因容器的限制有时会形成畸形根系。容器育苗的基质总量少，温度变化快，更容易受容器育苗的基质总量少，温度变化快，更容易受到高温或低温的伤害。到高温或低温的伤害。容器育苗的条件容器育苗的条件容器苗的生产设施容器苗的生产设施 n n育苗容器育苗容器n n按容器的形状分按容器的形状分按容器的形状分按容器的形状分 圆形、正方形、六角形、圆锥形、蜂圆形、正方形、六角形、圆锥形、蜂窝形等。窝形等。n n按容器的大小分按容器的大小分按容器的大小分按容器的大小分n n按制

49、作容器的材料分按制作容器的材料分按制作容器的材料分按制作容器的材料分 纸杯、纸杯、(软质、硬质、生物降解软质、硬质、生物降解)塑料容器、轻型基质网袋容器、泥炭容器、营养杯、营塑料容器、轻型基质网袋容器、泥炭容器、营养杯、营养篮等。养篮等。n n其他分类方式其他分类方式其他分类方式其他分类方式 单体容器、连体容器；具有易腐烂外壁单体容器、连体容器；具有易腐烂外壁的容器、具有不易腐烂外壁的容器、无外壁的容器；有的容器、具有不易腐烂外壁的容器、无外壁的容器；有底容器、无底容器。底容器、无底容器。常见容器简介常见容器简介纸杯纸杯纸杯纸杯 用牛皮纸或旧报纸粘合而成的育苗容器。高用牛皮纸或旧报纸粘合而成的

50、育苗容器。高121215 15 cmcm，径，径5 510 cm,10 cm,可做成双层，底部不粘合，容器呈筒状。可做成双层，底部不粘合，容器呈筒状。可重复使用可重复使用2 23 3次。次。塑料容器塑料容器塑料容器塑料容器 用聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯等制成。育苗钵用聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯等制成。育苗钵(有单体、连体之分，形状有方形、圆形两种，基部设排水有单体、连体之分，形状有方形、圆形两种，基部设排水孔；规格孔；规格8 cm8 cm6 cm8 cm8 cm6 cm、10 cm10 cm8 cm10 cm10 cm8 cm、12 12 cm12 cm12 cmcm12 cm12 cm等；穴