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1、 止凝血机制的止凝血机制的基础理论基础理论及及临床应用临床应用l白垚白垚l重庆医科大学附一院检验科 l 前前 言言血液凝固简称凝血，是血液由液体状态转为凝胶状态的过程，是哺乳动物止血功能的重要组成部分。凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者之间的动态平衡是正常机体维持体内血液液体流动状态和防止血液丢失的关键。第一节第一节正常止血机理、凝血过程概述正常止血机理、凝血过程概述止血是指由出血开始到出血停止的整个过程，而凝血仅指血浆形成纤维蛋白凝块这一过程。一、正常止血机制一、正常止血机制 l正常止血功能是维持生命所必需的生理功能，其过程极为复杂，它包括血管收缩、血小板凝集成白色血栓和形成纤维蛋白凝块三
2、个基本因素。整个止血过程大致可分成四期（为便于理解，人为划分）。l第一期为血管期第一期为血管期：当微血管损伤后，血管平滑肌通过交感神经的轴突反射使血管收缩（历时15-30秒）。使血流缓慢以利于初期止血。内皮损伤后所暴露出的胶原纤维，所释放的组织因子为启动凝血过程奠定了基础。单纯血管收缩在止血中所起的作用是短暂的。l第二期为血小板期：第二期为血小板期：血管收缩，受损血管的伤口缩小，血流减慢有利于血小板的粘附反应，聚集变性的血小板所释放的血管活性物质继而又加强了血管收缩使血流更为缓慢，更有利于血小板的进一步沉积与粘附。由于血小板的粘附，聚集变性，从而迅速形成血小板白色血栓。l第三期为血液凝固期第三
3、期为血液凝固期：聚集变性的血小板因其膜发生改变，而为凝血过程提供了必需的磷脂表面（PF3），且在血流缓慢的情况下，各种已激活的凝血因子更易发生作用，进一步形成一个以血小板栓为核心的凝血块，即红色血栓，从而起到持续止血的作用。l第第四四期期为为血血栓栓动动力力学学变变化化期期（血血管管修修复复期期）：凝血块的收缩有利于血管裂伤的愈合，存在于血管壁的凝血块反复地激活纤溶系统而使其自身被溶解，血管内皮的再生使微血管基本上恢复正常状态。l下面图示止血过程中各种因素的作用及相互之间的关系：血管壁损伤血管收缩组织凝血因子的释放胶原凝血酶被激活凝血酶二期血栓形成二期血栓形成（红色血栓）（红色血栓）血小板粘附
4、、聚集，“释放反应”血小板聚集体初期血栓形成初期血栓形成（血小板血栓）（血小板血栓）外源凝血系统内源凝血系统l二、正常凝血过程二、正常凝血过程l l 凝血是一个复杂的逐步扩大的连锁反应进程。凝血是一系列血浆凝血因子相继被激活的过程，最终结果是生成凝血酶，形成纤维蛋白。l 参与凝血的因子很多，其名称、作用途径及是否依赖维生素K的情况见下表。l1、凝血因子的名称及特点因子同义名称作用途径依赖维生素K纤维蛋白原共同凝血酶原共同+组织因子外源钙离子全部易变因子共同VI不存在稳定因子外源+抗血友病因子内源Christmas因子内源+l（续前表）l注：PK、HMWK没有编号，VI实际不存在因子同义名称作用
5、途径 依赖维生素KStuart-Prower因子共同+血浆凝血活酶前加速素内源Hegeman因子内源纤维蛋白稳定因子共同PK激肽释放酶原内源HMWK高分子量激肽原内源2、瀑布学说l有关凝血机制学说很多，但比较公认的是“瀑布”学说，凝血过程一般被分为内源性凝血途径和外源性凝血途径（其中包括凝血的共同途径），两条凝血途径的主要区别在于启动方式及参加的凝血因子不同，结果形成两条不同的因子X激活通路。大体上可以分为三个阶段：第一阶段，凝血活酶的形第一阶段，凝血活酶的形成；第二阶段，凝血酶原转变成为凝血酶；成；第二阶段，凝血酶原转变成为凝血酶；第三阶段，纤维蛋白原转变成纤维蛋白。第三阶段，纤维蛋白原转变
6、成纤维蛋白。内源凝血系统外源凝血系统表面接触（胶原，血小板凝聚）XIXIaCa2+VIIIXIIXIIaIXIXa+Ca2+PF3血小板凝聚并释放XXaPF3+V、Ca2+凝血活酶组织因子VII+Ca2+蛋白质部分XXa+V、Ca2+磷脂第一阶段凝血活酶凝血酶原（II）凝血酶（IIa）第二阶段第三阶段XIII纤维蛋白原纤维蛋白单体可溶纤维性蛋白不溶纤维性蛋白XIIIa凝块从前面的图示中，我们可以看到：在凝血过程中第第一一阶阶段段有两条途径可以激活FX。内源性途径：包括FXII、FXI、FIX和FVIII，血友病与FVIII、FIX和FXI有关，如果它们缺乏，FX、凝血酶原的激活将被减弱，止血便
7、出现障碍。另一途径，即外源性途径：包括组织因子（TF）、凝血酶原和FVII，先天性缺乏FVII是十分罕见的，TF广泛分布于身体各组织和器官，在主要组织器官损伤时能起到激活凝血酶的作用。第第二二阶阶段段中，凝血酶原在FXa和FV、Ca2+、PF3作用下转变成凝血酶。最最后后阶阶段段：凝血酶生成后，能快速地将纤维蛋白原转变成可溶性纤维蛋白，在FXIIIa（纤维蛋白稳定因子）作用下，可溶性纤维蛋白形成更稳定的网状结构的纤维蛋白。3.凝血机理的进展（1）凝血因子已公认为14个，增加的有PK、HMWK。（2）TF不 仅 激 活 外 源 性 凝 血 途 径，还 能 激 活 内源性凝血途径。（3）FXI被重
8、新定位。传统认为FXI是由FXIIa激活的，目前认为FXI是由凝血酶激活的。（4）组织因子途径抑制物（Tissue FactorPathwayInhibitor,TFPI）被发现。当TF被激活形成TF/FVIIa复合物后，会被TFPI的天然抗凝物质所抑制。TFPI有望成为一种新型的抗凝药物。4.抗凝机制 正常血管内皮细胞细胞网状内皮系统细胞抗凝功能抗凝血酶（AT-）蛋白C系统抗凝因子组织因子途径抑制物（TFPI）其它：肝素等l5.纤维蛋白溶解系统l最基本和核心成分是纤维蛋白溶解酶原。纤溶是正常人体的重要生理功能，在清除血管和腺体排泌管道内形成和沉积的纤维蛋白，保证管道畅通，防止血栓形成，排除伤
9、口或炎症灶内的纤维蛋白，促进伤口愈合等方面起重要作用第二节第二节 血液标本的采集、运送血液标本的采集、运送 l一一、血液标本的采集血液标本的采集l1、对患者的要求、对患者的要求l1.1患者要有思想准备。采血前医务人员要给患者讲明目的，努力减轻患者的心理压力，防止抽血时静脉挛缩。l1.2采血前要求空腹12小时以上，不作剧烈运动：休息1015分钟，取平卧位或坐位。l1.3采血前尽可能停止服用阿斯匹林、潘生丁、避孕药等，这些药物会影响凝血过程中的、因子。l2、对医护人员的要求对医护人员的要求l2.1取血用品选择取血用品选择l l采血所用注射器及血浆容器应用硅化玻璃或塑料制品。注射器针头国际推荐用21
10、G1.5或20G1.5（不应小于7号）。l l2.2抗凝剂及取血量抗凝剂及取血量l l枸橼酸钠（109mmol/L），一般抗凝剂与血液之比为1：9。必要时应按正常HCT计算枸橼酸钠的量。时取血后轻轻颠倒混合均匀（10次），避免用力振荡l2.3止血带的压力尽可能小，松紧程度以能阻止静脉血流动为宜。束缚时间尽可能短，一般不超过5分钟，最好在进针后见到血液流出就松开压脉带，因为压力大及束缚时间长可造成局部血液的浓缩和内皮细胞释放t-PA，后者将引起纤溶活性增强，血小板释放反应及一些凝血因子活性增加。l2.4取血时要慢而均匀，防止气泡产生，如果抽血过慢或不太顺利，可能激活凝血系统，试验结果将会显示出凝
11、血因子活性增高、血小板数假性降低等异常结果。l取出的第一管血可用作其它生化试验，第二管血作凝血试验。一旦取血完毕，应立即轻轻颠倒10次与抗凝剂充分混匀。用力过大会导致纤维蛋白原、因子变性。不允许从输液三通管取血。l二、二、血液标本的运送血液标本的运送ll、原则上取血后立即送检，要求自采血到测定结束在4小时内完成。血浆保存最好在零下80。l、运送中严防剧烈震动和阳光直射。l、冰箱保存应放在塑料管内，玻璃管可激活凝血因子（XII）。第三节第三节应用筛检试验诊断出血性疾病应用筛检试验诊断出血性疾病l出血是许多疾病的一种临床表现，故临床上见到一个出血的患者，首先要考虑这种出血是原发于出血性疾病，还是继
12、发于某种疾病的一个症状。一般认为，诊断出血性疾病首先要选择筛检试验，以其确定出血性疾病的类属；然后，再根据筛检试验的结果，选择确诊试验（费时，费用高），以其确定出血性疾病的诊断。筛检试验可以从以下三个方面，六项实验进行。若配套使用，可以初步了解止血、凝血和纤溶异常的概况。一、一期止血缺陷筛检试验的应用l一期止血缺陷是指血管壁和血小板异常所引起的止血功能的缺陷，主要是由于毛细血管壁通透性、脆性增加或血小板数量、质量异常所致的出血。l1、出血时间（BleedingTime,BT）l参考值范围：6.882.08min.BT是反映血管壁舒张、收缩和血小板数量、质量相互作用的试验。国际标准化出血时间测定
13、器法（templatebleedingtime,TBT）远较Duke法敏感和准确，重复性也较好。l2、血小板计数（Blood Platelet Count,BPC）lBPC的 参 考 值 范 围 是 是：100-300109/L。是反映骨髓生成、释放血小板和血小板被消耗、破坏之间平衡的试验。半自动化和全自动化血液分析仪计数血小板较镜下目视法为优。l3、结果分析：采用BT和BPC作为筛检试验，有以下情况。lBT和BPC都正常l除正常人外，多数是由于单纯血管壁通透性或脆性增加所致的血管性紫癜。临床上常见于过敏性紫癜、遗传性出血性毛细血管扩张症、单纯性紫癜、机械性紫癜、老年性紫癜，以及异常蛋白血症所
14、致血管性紫癜等。lBT延长伴BPC减少l多数是由于血小板数量减少所致的血小板减少性紫癜。临床上多分为原发性和继发性两种。后者常见于再生障碍性贫血、急性白血病、放疗和化疗后、弥散性血管内凝血（DIC）、脾功能亢进、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）和溶血尿毒症综合征（HUS）等。lBT延长伴BPC增多ll多数是由于血小板量增多所引起的血小板增多症。临床上多分为原发性和继发性两种。后者常见于慢性粒细胞性白血病、真红细胞增多症、骨髓纤维化以及严重感染、急性溶血、严重创伤和广泛性大手术等。lBT延长伴BPC正常l多数是于血小板功能异常或某些凝血因子缺陷所引起的出血性疾病。血小板功能异常多见于遗传性和获得
15、性血小板无力症，致密颗粒缺陷症、a颗粒缺陷症和血小板第3因子缺陷症等。某些凝血因子缺陷症主要是血管性血友病、低（无）纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症等。二、二期止血缺陷筛检试验的应用l二期止血缺陷是指凝血障碍和抗凝物质所引起的止血功能缺陷，主要是由于凝血因子缺乏或体内产生病理性抗凝物质所致出血。l1、活化部分凝血活酶时间（ActivatedPartialThromboplastinTime,APTT）lAPTT是反映内源凝血系统的常用筛检试验。是内源性凝血系统较敏感和常用的筛选试验,也是当前用于凝血因子治疗、肝素抗凝治疗监控及检测狼疮抗凝物的主要手段。l其参考值范围为：秒，结果超出正常对照1
16、0秒以上有意义。l2、血浆凝血酶原时间l(ProthrombinTime,PT）lPT是反映外源凝血系统的常用筛检试验。是监测口服抗凝剂的首选实验。l其参考值范围，以血浆凝固时间计：13-15秒，结果超出正常对照3秒以上有意义；以凝固时间比值（PTR值）计：；以国际标准化比率（INR）计：。l本试验应用标有ISI（国际敏感度指数）的试剂，INR值是监测口服抗凝剂较为敏感和准确的指标。l美国胸科医师协会推荐：肺梗死、心肌梗死、组织性心瓣膜置换、瓣膜性心脏病和心房颤动患者要求INR在2.03.0，心原性血管栓塞和机械性心瓣膜置换术患者要求INR在2.53.5。有文献报道,预防高危手术后发生静脉血栓
17、形成,INR只需1.52.5,治疗静脉血栓形成,剂量需增加到INR达2.02.5.lINRPTRISI，其中INR：国际标准化比率；PTR：凝血酶原时间比值患者PT正常人PT。lINR具有局限性:不适用于口服抗凝药初期的患者；不适用于肝病凝血因子缺陷患者；不适用于非抗凝治疗而PT延长的患者。3、采用APTT和PT为筛检试验的结果分析lAPTT和PT都正常l除正常人外，仅见于遗传性和继发性因子XIII缺乏症。获得性者常由于严重肝脏疾病、肝脏肿瘤、恶性淋巴瘤、抗因子XIII抗体、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血等引起。lAPTT延长伴PT正常l多数是由于内源凝血途径缺陷所引起的出血性病症，如血友病A
18、、血友病B、因子XI缺陷症；血循环中有抗因子VIII、抗因子IX或抗因子XI抗体存在；DIC时可见因子VIII、IX、XI减低，肝脏疾病时可见因子IX、XI减少，口服抗凝剂时可见因子IX减低、血管性血友病（VWD）等。lAPTT正常伴PT延长l多数是由于外源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子VII缺陷症，获得性者常见于肝脏疾病、DIC、血循环中有抗因子VII抗体存在和口服抗凝剂等。lAPTT和PT都延长l多数是由于共同途径凝血缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子X、V、凝血酶原（因子II）和纤维蛋白原（因子I）缺陷症；获得性者主要见于肝脏疾病和DIC，口服抗凝剂时可有
19、因子X和凝血酶原减低。此外，血循环中有抗因子X、抗因子V和抗因子II抗体存在时，它们也相应地延长。临床应用肝素治疗时，APTT和PT也都会延长。三、纤溶活性增强筛检试验的应用 l纤维蛋白溶解（纤溶）活性增强，临床上可分为原发性和获得性两种。所谓原发性有的也可找到明确的病因，是指组织纤溶酶原激活物（t-PA）或尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）的活性增强所致纤溶活性亢进；所谓继发性几乎都见于DIC，是指因子XIIa激活激肽释放酶原生成激肽释放酶，后者激活纤溶系统所致纤溶活性增强。1、纤维蛋白（原）降解产物检测（FibrincogenDegradationProducts,FDP）lFDP是纤维蛋
20、白原降解产物（碎片X、Y、D、E）和（或）纤维蛋白降解产物（碎片X、Y、D、E）的总和。是纤维蛋白原和纤维蛋白被纤溶酶裂解的总称。lFDP胶乳颗粒凝集法：正常参考值为阴性或血浆FDP5mg/L。l临床意义：原发性纤溶亢进时，FDP的含量可明显升高。因高凝状态，DIC、肾脏疾病、器官移植的排异反应、溶栓治疗等所致之继发性纤溶亢进时，FDP含量也升高。FDP检测是目前最敏感的纤溶活性增高的指标。ll2、D二聚体检测（PlasmaD-Dimer）lD二聚体是交联纤维蛋白在纤溶酶降解下产生的降解产物（碎片X、Y、D、E）。是目前认为DIC实验诊断中一个特异性较强的指标。血浆FDP升高和D二聚体的增多，
21、是继发性纤溶的两个很有价值的指标。FDP和D二聚体测定已逐步替代早先的3P实验和优球蛋白溶解时间测定。lD二聚体乳胶颗粒凝集法：正常参考值为阴性或0.5mg/L。3、结果分析：采用FDP和DD为筛检试验，有以下情况。FDP和DD均正常表示纤溶活性正常，表明临床的出血症状，与原发性或继发性纤溶无关。llFDP阳性伴DD阴性l理论上只见于纤维蛋白原被降解，而纤维蛋白未被降解，见于原发性纤溶亢进，见于肝病、术后大出血、重症DIC、纤溶初期、剧烈运动后、类风湿因子阳性、抗Rh(D)抗体存在等。lFDP阴性伴DD阳性l理论上只见于纤维蛋白被降解，而纤维蛋白原未被降解，见于血栓栓子自发性溶解。见于DIC、
22、静脉血栓、动脉血栓和溶栓治疗等。lFDP和DD均阳性l表示纤维蛋白原和纤维蛋白同时被降解，见于继发性纤溶亢进，如DIC和溶栓治疗。小小 结结l综上所述，对临床上疑有出血性疾病的患者，选择BT和BPC、APTT和PT、FDP和DD的配套试验，基本上可以起到出血性疾病和血栓性疾病的筛检作用。根据筛检试验的结果，再选择确诊试验，对出血性疾病可作出准确的诊断，避免误诊和漏诊。第四节、凝血检验的进展第四节、凝血检验的进展 l在某些因素的作用或刺激下，凝血因子、抗凝系统和纤溶系统，在它们的活化或代谢过程中发生了改变，表现出某些特征或释放出某些产物，这些特征或产物称为分子标志物。利用先进的、灵敏的方法检测这
23、些标志物，可以特异地和灵敏的反映凝血障碍的情况。一、凝血因子活化的标志物 l1凝血酶原片段1+2（F1+2）检测：l凝 血 酶 原 激 活 时，释 放 出 片 段1+2（F1+2）。F1+2是反映凝血酶原的活性，它是凝血酶原和凝血酶的分子标志物。正常人F1+2的水平极低，但在DIC、DVT、心肌梗塞、高血压、糖尿病、脑血栓形成、恶性肿瘤以及白血病等患者，血浆F1+2的水平升高。l2、纤维蛋白肽A（FPA-16）和纤维蛋白肽B（FPB-14）检测l它们是纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程中，在凝血酶作用下形成的。lFPA-16是观察癌肿是否转移的指标之一。不仅在冠心病、缺血性中风时升高，而且与心绞痛
24、的发作相一致，缓解后FPA-16转为正常。此外，DVT、DIC、肺栓塞、肾病综合征、SLE、烧伤、肝硬化时，FPA-16或FPA-14的水平也升高。故它们是反映凝血酶生成和活性的敏感和特异的发作标志物之一。l3、组织因子（TF）检测lTF存在于血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和各种组织上，与因子a形成复合物（Fa/TF），激活因子和因子。在DIC、血栓性疾病、内毒素血症、恶性肿瘤时血浆TF水平升高，反映外源性凝血系统的激活。l4、可溶性纤维蛋白单体复合物检测（SFMC）l失去肽A和肽B的Fg，可以自行聚合成能溶于5mol/L尿素溶液中，称为SFMC。lSFMC血浆水平的增高特异性地反映凝血酶活
25、性，在心肌梗塞、脑血栓形成、糖尿病、严重感染、急性早幼粒细胞白血病和DIC时，SFMC水平显著升高。二、抗凝和纤溶激活的标志物 l1.蛋白C活性肽（PCP）检测lPCP含量反映凝血酶-TM活性和PC被激活的程度，在先天性PC缺陷时会造成复发性血栓栓塞症；获得性PC缺乏见于肝病、DIC、手术后、尿毒症、成人呼吸窘迫综合症。l2.凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）llTAT是凝血酶与抗凝血酶以1：1摩尔相结合形成的复合物，从而灭活凝血酶。TAT增高见于恶性肿瘤、肺栓塞、DVT和DIC等。l3、纤溶酶-2抗纤溶酶复合物（PAP）检测l纤溶酶生成后，迅速与2抗纤溶酶以1：1摩尔形成复合物（PIC），并使
26、纤溶酶灭活，在血浆中PAP的增高直接反映纤溶酶的生成和纤溶酶活性的减弱，有利于血栓的形成。在DIC和血栓形成中，PIC血浆水平增高。进一步阅读参考书目l1.王振义，李家增，阮长耿主编，上海科学技术出版社，1996，第二版，血栓与止血基础理论与临床。l2.丛玉隆，王淑娟主编，中国科学技术出版社，1997，今日临床检验学。l3.巫向前主编，人民卫生出版社，2000，临床检验结果的评价。l4.李影林主编，人民卫生出版社，2000，中华医学检验全书。l5.陈允硕，周华文，张有康主编，上海科学普及出版社，2000，实用检验医学指南。思考题l1.正常止血机制和正常凝血过程。l2.凝血标本采集，运送及注意的问题。l3.为什么要应用筛检试验诊断出血性疾病？共有几个方面，几个实验？以及各项试验的用途。l4.INR的局限性有那些？