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1、第五章第五章 酶动力学引论酶动力学引论n n底物浓度底物浓度n n酶浓度酶浓度n npHn n温度温度n n激活剂激活剂n n抑制剂抑制剂主要内容主要内容研究各因素对酶催化反应速研究各因素对酶催化反应速度的影响度的影响1.底物浓度对酶催化反应速度的影响底物浓度对酶催化反应速度的影响 酶催化应速度与底物浓度的关系酶催化应速度与底物浓度的关系p203酶催化反应进程曲线酶催化反应进程曲线一底物或其他底物浓度不变时一底物或其他底物浓度不变时适用适用反应出现平衡的原因E+S ES E+PE+S ES E+P1 1+P+P2 2Note p2米氏方程V=VmaxS/(Km+S)V=KcatEtS/(Km+
2、S)Kcat:催化常数（酶的转化数）每秒种每个酶分子转换底物的微摩尔数Kcat/Km:专一性常数Km,Kcat,and kcat/Km米氏方程的意义米氏方程的意义n n米氏常数为反应速度是最大反应速度一半时的底物浓度，Km单位为摩尔浓度（mol/L）n nKm对于特定的反应条件而言是一个特征常数。它只与酶的性质有关而与酶的浓度无关，不同的酶，具有不同的Km值。n nKm值作为常数只是对固定的底物、一定的温度、一定的pH等条件而言的。n nKm值可以反映酶同底物的亲和力。Km在实际应用中的作用在实际应用中的作用n n鉴定酶n n判断酶的最适底物n n计算一定反应速度下的底物浓度n n了解酶的底物
3、在体内具有的浓度水平n n判断反应方向或趋势n n判断抑制类型是否复合是否复合MM方程方程Notepart2-10某酶促反应遵从某酶促反应遵从Michaelis-Menten动力动力学，酶的学，酶的Km为为2.410-4mol/L，当底物浓度，当底物浓度为为0.05mol/L时，其反应速度为时，其反应速度为128 mol毫升毫升-1 1分钟分钟-1-1，若底物浓度为，若底物浓度为1010-4-4mol/Lmol/L后，其反应后，其反应速度为多少？速度为多少？如如果果一一酶酶促促反反应应S=0.5Km，则则V值值等等于于多多少少Vmax?米氏方程的求法米氏方程的求法Lineweaver-Burk
4、plotAnEadie-Hofsteeplotv=-Km(v/S)+VmaxRandomsubstratebinding（随机机制）（随机机制）Orderedsubstratebinding（有序机制）（有序机制）双底物反应的反应机理双底物反应的反应机理N12Theping-pongmechanism eg.chymotrypsinEnzyme kinetics experiment2.酶浓度对酶催化反应速度的影响酶浓度对酶催化反应速度的影响 条件：无干扰因素存在，SKm应用：酶活力测定（在一定时间内产物的数量与酶浓度呈正比）S：8%8%，pH9pH9，T=60T=60 添加不同量的添加不同量
5、的AlcalaseAlcalase水解丝素的酶解进程曲线水解丝素的酶解进程曲线 pHpH对酶催化反应的影响对酶催化反应的影响影响酶的稳定性影响酶的稳定性影响酶与底物的结合以及酶催化影响酶与底物的结合以及酶催化底物转变成产物底物转变成产物Notep19-21 环环境境酸酸碱碱度度影影响响蛋蛋白白质质的的净净电电荷荷Juang RH(2004)BCbasics+Net Charge of a ProteinBuffer pHIsoelectric point,pI-3456789100-影响酶的影响酶的pHpH稳定性稳定性因素因素n n温度 n n是否存在辅助因子或其它小分子有关（Ca+）n n缓
6、冲剂的种类和浓度n n底物存在与否n n介质的离子强度n n介电常数n npH对酶的辅助因子或活化剂稳定性的影响温度温度辅助因子辅助因子猪胰猪胰-淀粉酶（含钙与否）的淀粉酶（含钙与否）的pH稳定性稳定性酶在酶在酶在酶在25250 0C C不不不不同同同同pHpH值保温值保温值保温值保温2020小时，然小时，然小时，然小时，然后在最适后在最适后在最适后在最适pHpH和含钙条件和含钙条件和含钙条件和含钙条件下测定活力下测定活力下测定活力下测定活力酶的酶的pH稳定性的实验测定稳定性的实验测定n n在不同的试管中加入同一种缓冲液，它们具有相在不同的试管中加入同一种缓冲液，它们具有相同体积但不同的同体积
7、但不同的pHpHn n将试管置于恒温水浴中平衡将试管置于恒温水浴中平衡n n在各个试管中加入相同体积的待测定的酶液在各个试管中加入相同体积的待测定的酶液n n在同一个在同一个pHpH和温度下测定酶的残存活力，这个和温度下测定酶的残存活力，这个pHpH不一定是酶的最适不一定是酶的最适pHpH，但是酶在此，但是酶在此pHpH下必须是稳下必须是稳定的定的n n根据上述实验步骤所得数据，作酶的百分残存活根据上述实验步骤所得数据，作酶的百分残存活力的对数力的对数-保温时间图保温时间图n n若仅测定一个保温时间后的残存酶活力，可仅作若仅测定一个保温时间后的残存酶活力，可仅作百分残存活力百分残存活力-pH-
8、pH图图酶在不同酶在不同pH下保温时的失活速度下保温时的失活速度pH对酶催化反应速度的影响对酶催化反应速度的影响n npH对酶的活性部位中心质子移变基团的离子化状态的影响n npH对底物离子化状态和反应的平衡位置参与酶催化的质子移变基团参与酶催化的质子移变基团pH对对 Chymotrypsin 活性的影响活性的影响5 6 7 8 9 10 11pH相相对对活活性性 Chymotrypsin 活活性性区区的的电电子子接接力力 Ser195His 57Asp 102HOCH2OCO-=Active SerHNNCCCHHCH2Ser195His 57Asp 102-OCH2OCOH=NNHCCCH
9、HCH2Histidine 上的上的 imidazole 基团基团HNNCCCHHH+pH 6pH 7+HNNHCCCHHInactive+Ser195His 57Asp 102HOCH2OCO-=HNNHCC-HCCH2HChymotrypsin 切出新的切出新的 Ile16 N-端端I16L13Y146Asp 194CH2COO-Ile 16NH2Ile 16+NH35 6 7 8 9 10 11pH相对活性pH 9pH 10pKaNew NH2-terminusChymotrypsin 要先經裂解後才有活性要先經裂解後才有活性245R15-I16Chymotrypsinogen(inac
10、tive)p-Chymotrypsin(active)S14-R15T147-N148Trypsina-Chymotrypsinogen(active)p-ChymotrypsinI16L13A149Y146Disulfide bonds新的新的 Ile16 N-端可端可稳定稳定 Asp194Asp 102His 57Ser 195Asp 194Gly 193Ile 16+NH3Catalytic Triad酶的最适酶的最适pHn n一般地说，一种酶仅在一个狭窄的pH范围内才具有最高的活力。n n其他实验参数：反应的时间、温度、底物的性质及浓度、缓冲液的性质及浓度、介质的离子强度和酶制剂的纯度
11、等。EnzymepHOptimumLipase(pancreas)8.0Lipase(stomach)4.0-5.0Lipase(castoroil)4.7Pepsin1.5-1.6Trypsin7.8-8.7Urease7.0Invertase4.5Maltase6.1-6.8Amylase(pancreas)6.7-7.0Amylase(malt)4.6-5.2Catalase7.0同一种酶作用于不同底物时的最适pH存在差异 蛋白最适pH酪蛋白68明胶5丝素5Papain(木瓜蛋白酶)蛋白最适pH大豆蛋白、酪蛋白79肉糜6.3丝素？Alcalase丝素浓度丝素浓度S=8%S=8%，E/S=
12、12AU/Kg,T 55E/S=12AU/Kg,T 55 Alcalase Alcalase在不同在不同pHpH值下水解丝素的进程曲线值下水解丝素的进程曲线 最适pH的确定n n低温保藏n n高温处理：灭酶温度对酶催化反应速度的影响温度对酶催化反应速度的影响影响酶的稳定性影响酶的稳定性影响酶反应的速度影响酶反应的速度Notep28温度对酶稳定性的影响温度对酶稳定性的影响 酶分子的大小和结构 pH 离子强度 酶和体系中蛋白质的浓度 保温时间 活化剂和抑制剂温度对酶稳定性的测定温度对酶稳定性的测定n n先将酶液（不含底物）在不同的温度下保温，而先将酶液（不含底物）在不同的温度下保温，而其他条件保持
13、相同其他条件保持相同n n在不同的时间间隔，依次取出一定量的酶液置于在不同的时间间隔，依次取出一定量的酶液置于冰浴中保存，或直接加入到含有底物的反应混合冰浴中保存，或直接加入到含有底物的反应混合物中物中n n在相同的在相同的pHpH和温度下（酶在此条件下是稳定的）和温度下（酶在此条件下是稳定的）测定残存酶活力测定残存酶活力（只能测定酶的不可逆变性；未考虑底物可能对酶（只能测定酶的不可逆变性；未考虑底物可能对酶稳定性的影响）稳定性的影响）温度对反应速度的影响温度对反应速度的影响n n定量表示Q10=(速度）t+10/(速度)tn n大多数酶催化反应Q10的范围为23Arrhenius 方程式方程
14、式Enzyme Enzyme Optimum temperatureOptimum temperature(o oC)C)Trypsin Trypsin 3737PectinasePectinase50-5550-55Alcalase Alcalase 55-6055-60蛋白最适温度（）大豆蛋白55丝素？Alcalase：5560举例举例丝素浓度丝素浓度S S为为8%8%，E/S=12AU/KgE/S=12AU/Kg，pH 9pH 9 Alcalase Alcalase在不同温度下水解丝素的进程曲线在不同温度下水解丝素的进程曲线 最适温度的确定最适温度的确定Enzyme experiment
15、 of catalaseEnzymeInhibitionReversibleInhibitionCompetitiveinhibitionNoncompetitiveinhibition IrreversibleInhibition O (CH3)2CHO P OCH(CH3)2 F=Chymotrypsin Ser195 被被 DIFP 抑制抑制Diisopropyl-fluorophosphate(DIFP)O-H CH2Ser 195 O (CH3)2CHO P OCH(CH3)2 =O CH2Ser 195XX添加底物可抵抗酶竞争性抑制剂Reaction time酶活被抑制程度(%)1
16、00500不加底物添加基質+DIFP+DIFP&substrateXX五、抑制剂对反应速度的影响五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂（inhibitor）：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质1、不可逆性抑制：（不可逆性抑制：（irreversible inhibitionirreversible inhibition）抑制剂与酶）抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合，从而使酶活丧失，的必需基团以牢固的共价键结合，从而使酶活丧失，不能用透析、超滤等去除抑制剂不能用透析、超滤等去除抑制剂。如低浓度的重金属离子如低浓度的重金属离子HgHg2+2+、AgAg+、AsAs3+3+可与酶分子
17、可与酶分子SHSH结合，使酶活抑制。结合，使酶活抑制。路易士气路易士气巯基酶巯基酶失活的酶失活的酶n n重金属盐引起的巯基酶中毒可用二巯基丙醇（BAL）解毒。BALn n农药敌百虫、敌敌畏、1059等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶（Choline esterase）活性中心丝氨酸残基的羟基结合，使酶失活。有机磷化合物有机磷化合物羟基酶羟基酶失活的酶失活的酶敌百虫敌百虫敌敌畏敌敌畏有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂胆碱乙酰化酶胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱胆碱乙酰胆碱乙酰胆碱乙酰胆碱为生物体内传递神经冲动的重要物质。胆碱酯酶乙酰胆碱为生物体内传递神经冲动的重要物质。胆碱酯酶为羟基酶，有机磷杀虫剂中毒时，
18、此酶活受抑制，结果造为羟基酶，有机磷杀虫剂中毒时，此酶活受抑制，结果造成乙酰胆碱的堆积，造成神经过度兴奋直至抽搐而死。可成乙酰胆碱的堆积，造成神经过度兴奋直至抽搐而死。可用用解磷定解磷定来治疗。来治疗。可逆性抑制可逆性抑制1 1、竞争性抑制、竞争性抑制特点特点:抑制剂与底物结构相似抑制剂与底物结构相似.抑制剂与底物结合在酶的同一位点抑制剂与底物结合在酶的同一位点 抑制作用可被高浓度的底物减低以至消除抑制作用可被高浓度的底物减低以至消除.Km Km增大增大,Vmax,Vmax不变不变.1/V1/S1/Vmax-1/Km(1+I/Ki)竞争性抑制竞争性抑制无抑制剂无抑制剂抑制剂抑制剂斜率斜率=Km
19、/Vm(1+I/Ki)丙二酸、苹果酸、草酰丙二酸、苹果酸、草酰乙酸为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。乙酸为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。GluPABA（对氨基苯甲酸）（对氨基苯甲酸）喋呤喋呤HHNHCHCH2COOHCH2COOHNNNNCH2NHCOOHH2NSO2NHRH2N磺胺药磺胺药PABA+二氢喋呤二氢喋呤+GluFH2合成酶合成酶FH2FH4磺胺药与磺胺药与PABA结构相似，可与结构相似，可与PABA竞争竞争FH2合成酶的活性中心合成酶的活性中心FH2合成受抑制，合成受抑制，FH4随之减少，使核酸合成障碍，细菌生长繁殖随之减少，使核酸合成障碍，细菌生长繁殖受到抑制。而人体可直接吸收叶酸。
20、受到抑制。而人体可直接吸收叶酸。FH2还原酶还原酶氨甲喋呤（氨甲喋呤（MTX）是）是FH2还原酶的竞争性抑制剂，抑制人体还原酶的竞争性抑制剂，抑制人体内内FH4的合成，以致抑制肿瘤的生长。的合成，以致抑制肿瘤的生长。FAFH2还原酶还原酶FH2FH2还原酶还原酶FH42 2、非竞争性抑制、非竞争性抑制若若Ki=Ki，则，则Vmax减小而减小而Km不变，称非竞争性抑制。不变，称非竞争性抑制。1/V1/S-1/Km(1+I/Ki)/Vmax非竞争性抑制非竞争性抑制3 3、反竞争性抑制、反竞争性抑制特点：特点：S、I结构不相似，结合位点不同，增加结构不相似，结合位点不同，增加S反而加强抑制，反而加强
21、抑制，Km减小，减小，Vmax减小。减小。1/S1/V(1+I/Ki)/Vmax无无I反竞争性抑制反竞争性抑制斜率斜率=Km/Vm各种类型抑制的表观各种类型抑制的表观KmKm及及VmaxVmaxAngiotensinogen(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-protein)reninAngiotensinI(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)kinin ACE （kininaseII）AngiotensinII（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe）inactive fragments vasomotion angiotoninase angiotensin III aldosterone inactive fragmentsstorage capacity of sodium increasedRenninAngiotoninaseandKallikreinKininSysteminHumanBodyn nNote p48CoenzymesFunctionofcoenzymes